德雷维特综合征（Dravet Syndrome，DS）是一种伴有癫痫的脑病，并伴有多种神经精神疾病。在多达 90% 的病例中，该病是由 SCN1A 基因的功能性快乐缺失引起的，该基因编码电压依赖性钠通道（Nav1.1）的α亚基。新靶向疗法的临床前开发需要能在遗传和临床水平上再现该疾病的动物模型。在这里，我们描述了一种携带杂合子临床相关 SCN1A 突变（A1783V）的 C57BL/6 J 基因敲入小鼠品系，该品系表现出全方位的 DS 表现。这包括在出生后 8 周内 70% 的死亡率、热诱发癫痫发作的阈值降低（与对照同窝鼠相比低 4.7 °C）、认知障碍、运动障碍、焦虑、多动行为以及与环境互动的缺陷。相比之下，小鼠的交际能力相对较好。电生理学研究显示，自发性发作间期癫痫样放电随温度升高而增加。癫痫发作是多灶性的，在个体内部和个体之间有不同的起源。它们在大脑半球内/半球间传播，经常导致全身强直-阵挛发作。18F标记的氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG-PET）显示，Scn1aWT/A1783V小鼠大脑的葡萄糖摄取量全面增加。我们的结论是，Scn1aWT/A1783V 模型是评估 DS 新疗法的可靠研究平台。
一、研究简介
德雷维综合征（Dravet Syndrome，DS）是一种严重的早发性脑病（OMIM 607208），平均发病率为 1:20000。虽然它也被称为婴儿期重症肌阵挛性癫痫（SMEI），占癫痫患儿的 1.4%1 ，但癫痫发作并不是该病的唯一表现。在 “稳定期”，这些致残问题持续存在，并出现蹲踞步态和帕金森病特征，但癫痫发作频率较低。然而，癫痫猝死（SUDEP）的风险始终存在。总体而言，在工业化国家，DS 的死亡率估计为 15%4，其中约 50% 的病例死于 SUDEP，35% 的病例死于 SE。
近 90% DS 患者的遗传基础涉及 SCN1A 基因，该基因编码电压依赖性钠通道（Nav1.1）的α亚基。这种膜转运体对表达副阀素或体节素的 GABA 能抑制性中间神经元（分别为 PV 细胞和 ST 细胞）的功能至关重要。Nav1.1 活性不足会导致大脑兴奋/抑制平衡的改变，这是大多数临床表现的基础。
可能由于胚胎致死性的原因，SCN1A 的同基因缺失或功能缺失突变在人类中极为罕见。DS 患者通常表现为杂合突变，导致一个 SCN1A 等位基因功能失活9。在大约一半的病例中，突变的等位基因由于无义突变、移帧突变或剪接缺陷突变而产生截短的 Nav1.1 通道（分别为 17%、19% 和 9%）。另一半患者出现错义突变或帧内缺失，对通道功能的影响不一。在较低的严重程度中，导致中度损伤的错义突变与较轻的疾病有关，如遗传性癫痫伴发热性癫痫发作（GEFS+）。此外，Nav1.1 的多种功能性改变也可能导致其他神经系统疾病，如自闭症、家族性偏瘫偏头痛 和与衰老相关的脑损伤。
目前已描述了多种基于 Scn1a 改变的遗传小鼠模型。其中大多数模型依赖于该基因的缺失，要么是全基因缺失，要么影响特定的细胞群。在 C57BL/6 基因背景下，携带同源基因缺失的小鼠在出生两周后会无情地死亡，而幸福素不足的小鼠在 3 至 12 周龄时会出现自发性癫痫发作，死亡率升高，长期存活率仅为 20%。相比之下，129 Sv 背景小鼠的临床表现非常轻微。相反，在兴奋性神经元（Emx1-Cre 株系）中缺失 Scn1a 则不会出现癫痫表型。最近的一项研究表明，在 VGAT 表达细胞中携带 Scn1a A1783V 突变的小鼠 100%在出生后第 2522 天前死亡，这也支持了这一观点。为了缩小不同中间神经元群的影响范围，Nav1.1 在 PV 与 ST 细胞中被删除。结果显示，ST 细胞的缺陷仅导致轻微的表型。相反，PV 细胞缺陷的小鼠热疗诱发癫痫发作的阈值温度明显降低，并伴有行为异常。这可能解释了为什么不同研究在 ST 和 PV 细胞对特定表现（如多动和类似自闭症的行为）的作用方面存在差异。尽管这些工具有助于阐明 DS 的生理病理，但新疗法的临床前开发需要一种广泛使用的小鼠模型，该模型应能在遗传和表型水平上再现人类疾病。
为此，我们采用了在所有细胞中都存在杂合Scn1a A1783V突变的条件性基因敲入小鼠，并将其维持在C57BL/6J背景中。这是一个位于第 26 号外显子的致病性错义突变，以前曾在 DS 患者中描述过10,23，预计会影响位于 422 结构域 S6 段的 Nav1.1 失活门受体。在本报告中，我们描述了 DS 在癫痫活动、运动、行为和认知改变等各方面表现的显著再现。值得注意的是，美国国立神经疾病与中风研究所（NINDS）最近在癫痫治疗筛选计划（ETSP）的动物模型小组中采用了一个携带相同突变的基因敲入模型（B6(Cg)-Scn1atm1.1Dsf/J品系与Sox2-Cre表达小鼠杂交）。
二、研究结果
2.1 Scn1aWT/A1783V 小鼠死亡率高
B6（Cg）-Scn1a tm1.1Dsf/J品系含有Scn1a第26号外显子，其中一个等位基因的侧翼有loxP位点，其次是人源化的第26号外显子，在5348核苷酸处有C到T的变化（https://www.jax.org/strain/026133）。B6.C-Tg(CMV-Cre)1Cgn/J品系的小鼠在无处不在的CMV启动子控制下表达Cre。当这些品系杂交时，floxed 外显子会发生 Cre 介导的分裂，突变的第 26 号外显子会结合到该等位基因表达的成熟 mRNA 中。这种情况会发生在大约一半的后代中（基因型以下称为 Scn1aWT/A1783V）。在分析的所有案例中，死亡的幼鼠都是 Scn1aWT/A1783V 小鼠。断奶后存活的 Scn1aWT/A1783V 小鼠在第 8 周龄前的体重低于其 Scn1aWT/WT 幼仔（图 1a）。Scn1aWT/A1783V小鼠的存活率从断奶到6周龄急剧下降，然后保持相对稳定，约有25%的小鼠长期存活（图1b）。虽然这些动物的主要死因还需要进一步研究，但我们的结果表明是 SUDEP，因为自发性全身强直阵挛发作的频率（15% 的小鼠，从 3 周龄开始）不能解释所观察到的高死亡率。
图 1 Scn1aWT/A1783V 小鼠在出生后 6 周内体重减轻，死亡率较高。(a) 动物断奶后每周称重一次。各点代表平均值 ± SEM（雌性 Scn1aWT/WT 平均 n = 30；雌性 Scn1aWT/A1783V n = 20；雄性 Scn1aWT/WT n = 40；雄性 Scn1aWT/A1783V n = 15）。Scn1aWT/A1783V 和对照同窝小鼠的体重曲线在升高（p < 0.0001）方面存在显著差异，但在斜率方面没有显著差异（线性回归分析）。(b）断奶后（出生后第 21 天）小鼠的存活曲线有显著差异（p < 0.0001 对数秩检验）。值得注意的是，Scn1aWT/A1783V 小鼠在断奶前的死亡率为 24%。
在 mRNA 水平量化的 Scn1a 表达分析表明，Scn1aWT/A1783V 小鼠的海马中度减少（图 2a），但通过 Western 印迹在任何脑结构的膜富集提取物中均未观察到 Nav1.1 含量的显著变化。如果有的话，其减少量将低于 20%（图 2b），而且在脑样本的免疫荧光分析中也未发现明显差异（图 2c、d）。这符合杂合子错义突变的预期结果。
图 2 Scn1aWT/A1783V 小鼠海马的 Scn1a mRNA 水平降低，但任何脑区的蛋白质水平均无显著差异。(a）通过 qRT-PCR 测定 Scn1aWT/A1783V 和年龄匹配的同窝小鼠（5-8 个月）皮层（Ctx）、海马（HC）和小脑（Cb）中 Scn1a 的 mRNA 水平。数值（根据 GAPDH mRNA 水平归一化）以相对于对照同窝鼠的百分比计算，数据以平均值 ± SEM 表示（Scn1aWT/WT 小鼠 n = 6，Scn1aWT/A1783V 小鼠 n = 8）。*p < 0.05 Kruskal-Wallis 与 Dunn 后检验。(b) 从 Ctx、HC 和 Cb 中制备的膜富集蛋白提取物用于通过 Western 印迹评估 Nav1.1 蛋白含量。条形图代表与 GAPDH 值归一化的单个测定的密度分析。数据以对照组小鼠（Scn1aWT/WT 小鼠 n = 6，Scn1aWT/A1783V 小鼠 n = 8）归一化值的平均百分比 ± SEM 表示。对照组与 Scn1aWT/A1783V 小鼠之间未发现统计学差异。右图为显示 Nav1.1 和 GAPDH 条带的代表性印迹。原始印迹经过裁剪和重新排列，以显示 Scn1aWT/A1783V 和对照组小鼠的分组情况。全长印迹见补充材料。(c）牺牲其他小鼠，通过免疫荧光（绿色）分析 Nav1.1。细胞核用 DAPI（蓝色）染色。图像显示了指定的大脑区域：前额叶皮层（pCtx）；HC 的齿状回（HC-DG）；以及代表性小鼠的 Cb（两组动物均为 4 只）。根据艾伦成年小鼠大脑参考图谱，每个结构的不同区域都用虚线划定。在 pCtx 中，罗马数字表示其不同层。在 HC-DG 中，包括以下区域：CA1 的 lacunosum-molecurare 层（CA1-slm）；齿状回的分子层（GD-mo）、颗粒细胞层（DG-sg）和多形性层（DG-po）。Cb 中：分子层（ml）、白质（wm）、浦肯野细胞层（pcl）和颗粒层（gl）。比例尺为 200 微米。(d）为了研究 Nav1.1 通道的亚细胞定位，使用激光共聚焦扫描显微镜观察组织切片。面板显示了在具有代表性的小鼠皮质 V 后期（Ctx-LV）、HC-DG 和 Cb 中观察到的标记（两组动物 n = 4）。比例尺为 20 µm。
2.2 Scn1aWT/A1783V 小鼠出现异常发作间期活动和热诱导癫痫发作
为了确定该DS模型的癫痫发作阈值温度，Scn1aWT/A1783V及其相应的对照同窝小鼠在不同的年龄间隔（1-2、2-4和4-6月龄）接受热疗。所有 Scn1aWT/A1783V 小鼠都出现了临床可识别的癫痫发作，平均阈值为 38.2 ± 2.9 °C（图 3a）。相比之下，80%的 Scn1aWT/WT 小鼠只有在温度升高到最高 45 ℃ 时才会出现癫痫发作（图 3b），平均阈值为 42.9 ± 1.4 ℃。
图 3 Scn1aWT/A1783V 易受高温诱发的癫痫发作影响。将指定年龄范围的小鼠暴露于温度每 30 秒升高 0.5 ℃直至 45 ℃或达到全身抽搐的受控高热室中。(a) 在所有测试年龄段，Scn1aWT/A1783V 的阈值都明显低于对照同窝鼠。这些差异在所有测试的年龄范围内都保持不变（Scn1aWT/WT：1-2 个月 n = 23，2-4 个月 n = 27，4-6 个月 n = 9；Scn1aWT/A1783V：1-2 个月 n = 26，2-4 个月 n = 20，4-6 个月 n = 13）。***p < 0.001，单因素方差分析，Tukey 后检验。(b) 累计癫痫发作概率显示，Scn1aWT/WT小鼠在所有年龄段的癫痫发作风险都局限在40-45 °C之间，而Scn1aWT/A1783V在年轻时的温度范围更广。
为了研究 Scn1aWT/A1783V 和 Scn1aWT/WT 小鼠之间的电生理差异，我们对 1-3 岁年龄段的小鼠进行了多点记录（海马和前额叶皮层）（图 4）。在室温（RT）下，对清醒、自由活动的小鼠进行 30 分钟的电生理活动和同步数字视频记录，发现所有 Scn1aWT/A1783V 小鼠（5 只中有 5 只）都存在发作间期癫痫样放电（IEDs）。IEDs放电由孤立或成群的尖峰（多尖峰）组成，持续时间很短（<20 ms），振幅很高（>100 µVpp），高于背景活动（图 4a）。我们观察到了局灶性（即在单个通道中出现 IED）和泛化性（同时在多个通道中出现 IED）分布。有趣的是，在小鼠的 Scn1aWT/WT 同窝雌鼠（5 只中的 5 只）中均未检测到 IED。然后记录小鼠在温度升高时的大脑活动（图 4a）。在调查的温度范围内（28-42 °C），没有一只 Scn1aWT/WT 小鼠出现临床发作（有行为表现的电性发作）或亚临床发作（无明显行为表现的电性发作），也没有出现 IED。相反，Scn1aWT/A1783V小鼠的IED发生率随着温度升高而增加（图4a），最终导致所有动物出现临床（4/5）或亚临床（1/5）热诱导癫痫发作。Scn1aWT/A1783V 小鼠的癫痫发作持续数分钟。通过目测同步视频和电生理记录，可以根据修订后的小鼠拉辛量表（rRS）25 将电生理活动的变化与行为表现联系起来。
图 4 自由移动的 Scn1aWT/A1783V 小鼠的电生理学特征。(a）Scn1aWT/WT（上）和 Scn1aWT/A1783V（下）小鼠在热挑战期间记录的电活动示例。将两个月大的动物（n = 5）放入加热室，温度逐渐升高，同时记录前额叶皮层/额叶联想皮层（PFC）、CA1 和齿状回（DG）区域的电活动。在 Scn1aWT/A1783V 小鼠的情况下，癫痫发作开始于 t = 1,700 s 左右，T = 38.94 °C。尽管热源被立即断开，但即使将动物从记录室中移出（t = 2250 秒左右），癫痫发作仍然持续，并且成群出现。请注意，IEDs 存在于 RT 阶段（t < 1,000 s），而且随着温度的升高，其频率也在增加，并在癫痫发作前达到最大值（下图）。相比之下，Scn1aWT/WT 小鼠既没有出现 IED，也没有癫痫发作（上图）。(b）起源于 DG 局灶并进一步泛化的癫痫发作示例（见箭头）。
在两个病例中，通过电生理记录可以发现病灶起源于海马齿状回，并进一步扩散到海马和前额叶皮层的其他区域（见图 4b）。
2.3 Scn1aWT/A1783V 小鼠出现认知障碍
在不同年龄段（1-3 个月、3-5 个月和 5-8 个月）使用莫里斯水迷宫（MWM）测试评估小鼠的空间学习和记忆能力。测试的可见平台阶段显示，Scn1aWT/A1783V小鼠学习新任务的速度比对照组小鼠慢，这与在DS患者中观察到的认知延迟一致（图5a）。两组小鼠在空间记忆方面的差异更为显著，如测试的隐形平台阶段所示。这表明，Scn1aWT/A1783V小鼠无法利用视觉线索加速确定隐藏平台的位置。探针测试在所有年龄组中都显示出显著差异，这与小鼠在保持能力方面的缺陷一致。
图 5 Scn1aWT/A1783V 小鼠表现出涉及任务学习和视觉空间记忆的认知改变。(a）在不同年龄进行的MWM测试显示，与同窝对照组相比，Scn1aWT/A1783V小鼠在可见平台（VP）上的逃逸潜伏期增加，尽管两组小鼠都存在显著的学习能力（P < 0.001 Friedman检验）。相反，小鼠在隐形平台（IP）上的表现在绝对潜伏期和曲线斜率上都存在差异，这表明 Scn1aWT/A1783V 小鼠在整个训练过程中都无法改善其逃逸潜伏期（Friedman 检验，Scn1aWT/A1783V 和 Scn1aWT/WT 小鼠分别为 p > 0.05 和 p < 0.001）。与缺乏空间学习一致的是，Scn1aWT/A1783V小鼠在探针测试中没有表现出对目标象限的偏好，这与保留的改变一致。数值以平均值 ± SEM 表示（Scn1aWT/WT：1-3 个月 n = 11，3-5 个月 n = 12，5-8 个月 n = 27；Scn1aWT/A1783V：1-3 个月 n = 17，3-5 个月 n = 10，5-8 个月 n = 24）。(b）对相同年龄组的小鼠进行 NOR 试验。虽然在训练 1 小时后未观察到差异（左图），但在 Scn1aWT/A1783V 小鼠中长期记忆显著减少（NOR 24 小时），显示了记忆巩固的缺陷。数值以平均值 ± SEM 表示（Scn1aWT/WT：1-3 个月 n = 37，3-5 个月 n = 26，5-8 个月 n = 27；Scn1aWT/A1783V：1-3 个月 n = 28，3-5 个月 n = 30，5-8 个月 n = 37）。对于 VP1-2、IP5、IP8、探针 15 第 4 天、探针 15 第 7 天、NOR 1 小时和 NOR 24 小时，采用单因子方差分析和 Tukey 后检验评估统计相关性；对于 VP3-5、IP1-4、IP6-7 和探针 15 第 9 天，采用 Kruskal-Wallis 和 Dunn 后检验评估统计相关性。Scn1aWT/A1783V和Scn1aWT/WT小鼠的比较中，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。符号 *、+ 和 # 分别对应 1-3 个月、3-5 个月和 5-8 个月的年龄范围。
新物体识别测试显示，小鼠的短期视觉空间记忆（训练后 1 小时）没有差异（NOR 1 小时，图 5b）。然而，与对照组小鼠相比，Scn1aWT/A1783V小鼠在疾病的轻度和晚期阶段出现了长期视觉空间识别记忆障碍（NOR 24小时，图5b），表明该动物模型的记忆巩固失败，这与在MWM中获得的结果相吻合。
2.4 Scn1aWT/A1783V 小鼠出现运动改变
Scn1aWT/A1783V 小鼠断奶后步态和运动异常明显。为了量化小鼠的运动技能，对小鼠进行了一系列测试，包括旋转木马、倒立网格和高架横梁。这些测试结果显示，小鼠的协调和平衡能力明显受损，这与 DS 患者的临床观察结果相符（图 6）。总体而言，Scn1aWT/A1783V小鼠的运动能力随着时间的推移而下降，但只有在比较早期和晚期年龄组时，这一趋势才在转体测试中达到统计学意义（图6a）。
图 6 Scn1AWT/A1783V 小鼠表现出运动障碍。(a-c）对所示年龄段的小鼠进行旋转木马、倒网格和高架横梁测试。与对照同窝小鼠相比，Scn1AWT/A1783V 小鼠从旋转杖上跌落的潜伏期缩短，从 3 个月大开始就观察到显著差异。在其他两项测试中，所有年龄组都观察到了明显的下降。每个条形图代表经过时间（秒）的平均值±SEM，并且是至少两次试验的平均值（Scn1aWT/WT：1-3 月龄 n = 31/25/19，3-5 月龄 n = 16/19/14，5-8 月龄 n = 24/14/26；Scn1aWT/A1783V：1-3 月龄 n = 18/13/11，3-5 月龄 n = 16/29/14，5-8 月龄 n = 25/16/31；分别在进行的每个试验中）。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。a）为单因素方差分析，Tukey 后检验；（b,c）为 Kruskal-Wallis 和 Dunn 后检验。
2.5 Scn1aWT/A1783V 小鼠表现出多动和焦虑
DS 小鼠模型的行为表现在很大程度上受特定 Scn1a 缺陷和遗传背景的影响18,19,20。为了研究 Scn1aWT/A1783V 小鼠这方面的情况，我们采用了开阔地测试。虽然小鼠移动的总距离与对照组小鼠没有差异，但观察到的最显著差异是小鼠在竞技场中心停留的时间（图 7a）。这是这些小鼠焦虑行为的一个重要指标。此外，与对照组相比，Scn1aWT/A1783V 表现出更快的峰值速度（图 7b），这表明它们具有多动/冲动性。这一结果与动物处理过程中观察到的行为一致。为了支持多动行为，我们观察到从 3 个月大开始，重复动作（刻板印象）的数量有所增加（图 7c）。在出现这些多动迹象的同时，探索行为也受到了严重影响，这一点可以从埋弹珠测试中看出。Scn1aWT/A1783V小鼠掩盖笼子中发现的物体的正常趋势明显降低（图7d）。为了研究一种复杂的、物种适应的行为，以评估个体在日常生活活动中的表现，我们进行了筑巢试验。在Scn1aWT/A1783V小鼠中观察到筑巢能力急剧下降，超过80%的个体在所有测试年龄间隔内都无法开始筑巢（图7e）。与这些行为改变不同的是，在对小鼠进行社会互动测试时，我们只发现了小鼠社会性受损的轻微迹象26。中间年龄组的 Scn1aWT/A1783V 小鼠在 15 分钟的共栖期间接触次数适度减少，同时首次接触的潜伏期延长（图 7f）。由此看来，接触次数减少的主要原因是首次互动建立的延迟，这可能受到其他运动和行为缺陷的影响。这一发现与 DS 患者的临床特征相符，由于认知障碍，DS 患者的社交能力比沟通能力更强27。
图 7 Scn1AWT/A1783V 小鼠与环境的相互作用发生改变。对指定年龄段的小鼠进行开阔场地测试，结果表明，小鼠在场地中心停留的时间减少–这表明小鼠焦虑（a）、过度运动（b）和刻板行为增多（c）。在任何年龄范围内，总移动距离均未发现差异（数据未显示）。动物行为的其他改变包括：在埋大理石试验中隐藏物体的正常倾向降低（d），以及在筑巢试验中表现不佳（e）。图中表示的是在一个晚上完成、启动或未启动任务的小鼠百分比（分别为深色、中色和浅色）。相比之下，Scn1AWT/A1783V 在社交互动任务（f）中表现相对较好，与对照同窝鼠相比，仅在 3-5 个月的年龄范围内观察到接触次数减少（左 Y 轴），同时首次接近陌生小鼠的潜伏期（右 Y 轴）显著增加。数值以平均值 ± SEM 表示（Scn1aWT/WT：1-3 月龄 n = 44/44/14/26/16/16，3-5 月龄 n = 31/30/13/34/6/11，5-8 月龄 n = 29/27/17/8/17/18；Scn1aWT/A1783V：1-3 月龄 n = 26/29/14/20/6/15，3-5 月龄 n = 33/34/9/37/12/11，5-8 月龄 n = 35/36/24/18/20/15；分别在每个测试中进行）。*p < 0.05; ***p < 0.001, Kruskal-Wallis with Dunn’s post-test.
2.6 Scn1aWT/A1783V 小鼠脑内葡萄糖摄取增加
最近有研究表明，DS 患者从 6 岁开始出现脑葡萄糖摄取异常28,29。特别是在前额颞顶叶皮层，葡萄糖摄取减少。尽管研究还很有限，但这一细胞代谢指标可能成为这些患者脑功能的预后因素和/或治疗反应的标志。因此，我们对中青年 Scn1aWT/A1783V 小鼠和未接受任何热诱导癫痫发作的年龄匹配对照组进行了 18 FDG-PET。与目前的临床报告不同，我们观察到 Scn1aWT/A1783V 小鼠大脑中葡萄糖摄取量的全面增加。以肝脏作为参考器官，可以看到脑排放的净增加（图 8a）。小鼠随后被处死，并分离出不同的大脑结构以量化放射性核素的掺入。在小脑、基底节、脑干、皮层、丘脑和海马等所有区域都观察到了较高的吸收率（图 8b）。下文将讨论近期临床报告与我们的结果之间存在明显差异的潜在原因。
图 8 Scn1aWT/A1783V 小鼠脑内葡萄糖摄取增加。小鼠在指定年龄接受 18F-FDG PET。(a）左图是具有代表性的小鼠的最大强度投影 PET 图像，显示脑部 18F-FDG 摄取。右图为正电子发射的定量（平均 SUV）。(b）5-8 岁组的小鼠在 PET 治疗后被处死，伽马计数器对同位素掺入量进行量化（以注射剂量的百分比表示）。(1-2月龄 n = 7；5-8月龄 n = 14）。*P < 0.05；**P < 0.01。Mann Whitney U 检验。
三、研究讨论
DS 是一种影响大脑抑制/兴奋平衡的复杂脑病，因此临床表现多种多样。除癫痫发作外，其他并发症也对患者及其家人的生活质量产生深远影响。因此，针对 SUDEP，运动、认知和行为改变是新实验疗法的明确目标，以患者为中心，寻求治疗效果。在这种情况下，相关的临床前模型和量化治疗反应的可靠方法正成为该领域的当务之急。在本报告中，我们描述了一种小鼠模型的特征，在这种模型中，患者体内反复出现的错义 Scn1a 突变存在于所有细胞中，因此在基因水平上模拟了与临床相关的情况。我们的研究结果表明，Scn1aWT/A1783V小鼠中存在最相关的DS表现，并且可以通过标准化测试轻松量化。这些表现包括对热诱导癫痫发作的明显敏感性、脑电图改变、进行性运动障碍、多动和认知退化。
行为改变可能是 DS 患者中最多变的表现，在临床前小鼠模型中也是如此。除了使用啮齿动物测试区分不同行为特征的固有困难外，遗传背景和受 Scn1a 改变影响的细胞类型也有很大影响。这可能是受 C57BL/6 J 遗传背景的影响，该背景对社会交往缺陷具有相对抵抗力。事实上，在这种背景下，Scn1a的PV特异性happloinsufficiency表现出正常的社会行为，只有全面引入无义突变（Scn1aRX/+小鼠）才会导致社会性测试的改变。另一方面，DS 患者社交能力下降的原因与其说是特定的社交障碍，不如说是交流困难和认知障碍。此外，还应考虑到小脑改变对内化综合征的影响。
与之前描述的携带与 GEFS+ 相关的 R1648H 突变的基因敲入模型（Scn1a RH+ 小鼠）相比，Scn1aWT/A1783V 的共同点是多动和轻度社交障碍，而 DS 突变会导致更深的认知障碍、焦虑和更高的死亡率。有趣的是，最近的一项研究表明，杂合子 Scn1a RH+ 小鼠的表型可因反复高热诱导的危机而加重。这一发现凸显了遗传和环境因素在疾病进展中的相互作用。
最后，我们首次报告了在 DS 小鼠模型中进行的 FDG-PET 研究，这可能是该疾病脑功能的一个间接但与临床相关的标志物。与针对 DS 患者的开创性报告不同的是，我们发现不同大脑结构的葡萄糖摄取量均有所增加。考虑到 Scn1a 功能不足导致的不平衡兴奋活动，这并不奇怪。我们认为，临床研究中观察到的葡萄糖摄取明显减少可能受到患者使用的抗癫痫药物以及这些研究中使用的归一化方法的影响。我们的数据表明，这两个脑区的正电子发射摄取量都升高了，这使得结果的解释变得复杂。耐药性癫痫患者的脑代谢通常会降低，特别是由于长期处于癫痫发作状态。然而，在持续致痫活动的发作间歇期也有代谢亢进的描述。
总之，我们在此介绍一种基于临床相关基因改变的 “开放性 ”DS 小鼠模型，该模型可对多种疾病表现进行定量评估。本报告中描述的方法选择涵盖了临床、电生理和代谢水平上最相关的参数。我们相信，这可能是测试新型疗法和在不同研究小组间获取有意义数据的有用工具。
四、研究材料与方法
4.1 动物
将条件性 Scn1a-A1783V 小鼠（B6(Cg)-Scn1atm1.1Dsf/J，The Jackson Laboratory，库存编号：026133）与在 CMV 启动子控制下表达 Cre 重组酶的小鼠（B6.C-Tg(CMV-Cre)1Cgn/J，The Jackson Laboratory，库存编号：026133）进行繁殖。026133）与在 CMV 启动子控制下表达 Cre 重组酶的小鼠（B6.C-Tg(CMV-Cre)1Cgn/J，The Jackson Laboratory，库存编号：00605439）进行杂交。00605439). 繁殖对由杂合雄性 Scn1a-A1783V 和同源杂合雌性 CMV-Cre 小鼠组成。有关等位基因改造和基因分型的详情，请参阅 https://www.jax.org/strain/026133。携带一个突变等位基因的后代（基因型以下称为 Scn1aWT/A1783V）会在所有身体组织中表达 Scn1a 基因的 A1783V 突变，模拟 DS 的情况。动物每笼 4-6 只，可自由获取食物和水，每周称重一次，并在温度和光照受控（12 小时/12 小时光/暗循环）的环境中饲养。研究将杂合转基因 Scn1aWT/A1783V 与年龄匹配的阴性同窝鼠 Scn1aWT/WT 进行比较。育种和实验方案经纳瓦拉大学伦理委员会批准（符合西班牙第 53/2013 号皇家法令）。
4.2 定量 PCR
为了尽量减少这部分研究中使用的动物数量（仅限于 6 只 Scn1aWT/WT 和 8 只 Scn1aWT/A1783V），每只动物的一个大脑半球和半个小脑被解剖并用于通过定量 PCR 检测 Scn1a 基因的 mRNA 水平，另一只用于通过 Western 印迹检测 Nav1.1 蛋白水平。解剖大脑皮层、海马和小脑后，使用 Maxwell® 16 LEV simplyRNA 细胞试剂盒按照生产说明分离总 RNA。然后用 DNase I 处理两微克 RNA，并使用 M-MLV 反转录酶和随机引物反转录成 cDNA。这些过程在 GeneAmp® PCR 系统 2400中进行。使用 iQTM SYBR® Green Supermix 试剂在 CFX96 TouchTM Real-Time PCR 检测系统中进行实时 PCR 定量分析。使用特异性引物（FP 5′ CATGTATGCTGCAGTTGATTCCA 3′和 RP 5′ AACAGGTTCAGGTAAAGAAGG 3′)40 和小鼠 GAPDH 作为管家基因（FP 5′ CCAAGGTCATCCATGACAAC 3′ 和 RP 5′ TGTCATACCAGGAAATGAGC 3′）。所有脑样本均一式三份。使用 2-ΔCt41 进行相对定量。数据以相对于 Scn1aWT/WT 小鼠的百分比进行分析，并以平均值 ± SEM 表示。
4.3 膜富集提取物的制备和 Western 印迹
按照之前的描述 ，使用另一半球的大脑皮层和海马以及一半的小脑来获得膜富集蛋白部分（P2）。蛋白质浓度通过布拉德福德测定法测定，部分制备物在变性条件下溶解，如前所述43。蛋白质样品与 4x 尿素-EDTA 缓冲液混合，在 SDS 聚丙烯酰胺凝胶上解析，然后转移到 PVDF 膜上。在 TBS 中加入 5% BSA 和 0.05% Tween-20 阻断膜，然后用以下一抗于 4 °C 孵育过夜：兔多克隆抗 Nav1.1 （Alomone Labs Cat. 1（Alomone Labs Cat# ASC-001，Cat# 2118S，1:500）和兔单克隆（14C12）抗 GAPDH。使用抗兔 IgG HRP 结合物（GE Healthcare，Cat# NA934V，1:10,000）和增强化学发光系统检测免疫标记的蛋白条带。使用 Chemidoc 系统采集图像，并使用 Image LabTM 软件进行定量。所使用的抗 Nav1.1 抗体是针对大鼠 Nav 1.1 结构域 I 和 II 之间细胞内环相应的合成肽的亲和纯化兔多克隆抗体。该抗体已通过 KO 验证 ，并在多篇论文中通过 Western 印迹免疫荧光验证，数据以相对于 Scn1aWT/WT 小鼠的百分比进行分析，以平均值 ± SEM 表示。
4.4 诱发热性癫痫发作
为了评估不同年龄段动物模型的致痫热阈值，我们使用了一个甲基丙烯酸酯圆筒，该圆筒与一个可逐渐升高其内部温度的热系统相连。在将动物引入圆筒之前，使用直肠探针（RET-4，Physitemp Instruments, LLC）测量其体温，该探针与 TCAT-2LV 控制器（Physitemp Instruments, LLC）相连。环境温度逐渐升高至最高 45 °C（每 30 秒升高 0.5 °C）或直至出现全身抽搐。将动物从圆筒中取出并按前述方法测量其体温后，将其置于可自由取水的冷藏箱中，以帮助其恢复。
4.5 电生理记录
在 5 只 Scn1aWT/A1783V 和 5 只 Scn1aWT/WT 小鼠 2 个月大（71 ± 18 天）时，通过多点记录对 DS 模型进行电生理表型分析。小鼠海马CA1区和前额叶皮层的局部场电位（LFP）与同步视频记录同时被采集。为此，在小鼠CA1和齿状回（DG）的不同层植入了5根等间距的50微米钨丝，并在前额叶皮层、额叶联想皮层（PFC）植入了一根钨丝。电极放置坐标根据 Paxinos 和 Watson 地图集选定：(AP)：-1.94 毫米；(ML)：1.5 毫米；(DV)：-2 至 -1 毫米：海马束：-2 至 -1 毫米；（AP）：2.58 毫米；（ML）：1.5 毫米；（DV）：-1.5 毫米：PFC：-1.5 毫米。参考螺钉和接地螺钉放置在小脑上。植入一周后（伦理委员会建议的手术和炎症恢复时间），将动物连接到电生理记录采集系统（Intan RHD2000 系统，IntanTech）。同时进行的视频记录用于评估动物的行为状态和是否出现（临床）癫痫发作。记录过程从小鼠在笼子内清醒、自由活动的 30 分钟记录开始。开场记录后进行热挑战，将小鼠放入加热室，在温度从 RT 升高到 42 °C 或出现癫痫发作时进行记录。在 Matlab下运行的定制例程用于将电生理数据和温度值从 Intan 格式转换为 Spike2 格式。使用 Spike2 软件的审查功能对记录进行目视检查，以评估是否存在异常活动（发作间期放电）、电抽搐和抽搐开始时的体温值。发作间期痫样放电（IEDs）是按照先前描述的方法进行初步检测并通过目视检查进一步验证后半自动注释的。
东莞富临医疗科技有限公司是 Intan 亚洲代理商，为亚洲客户供应 Intan 电生理产品与配套产品
4.6 免疫荧光程序、设备和设置
在甲苯/氯胺酮麻醉下，用 0.9%生理盐水和 4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PB）对其他动物进行经心灌注。灌注后，取出大脑，在相同的固定液中于 4 ℃ 固定 12 小时，然后在 30% 蔗糖溶液中于 4 ℃ 低温冷冻保存，直至下沉。用冷冻显微切片机矢状切割显微切片（厚度：30 μm），并在-20 °C的低温保存液（30%乙二醇、30%甘油在0.1 M PB中）中保存至处理。为使细胞核可见，切片与 DNA 标记 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，ThermoFisher Scientific Cat# D1306，300 nM）避光孵育 5 分钟。最后，切片用 PB 冲洗两次，装在 super frost plus 载玻片上，风干 24 小时，用甲苯冲洗（2 × 5 分钟），盖上盖玻片，用 Immu-Mount® 安装介质（ThermoFisher Scientific Cat# 9990402）安装。图 2c 中显示的荧光信号是使用配备超高压汞灯的荧光显微镜 Eclipse Eboom（尼康）和 Plan Apo 10 ×/ 0.45 DIC L 物镜采集的。使用 DS-Ri2 相机（尼康，日本。捕获质量：3 × 8 位，4908 × 3264）和 NIS-Elements F 4.60.00 64 位程序。B-2A 滤光片（激发波长：450-490 nm，DM：505，BA：530）用于检测 Nav1.1 免疫染色结构，UV-2A 滤光片（激发波长：330-380，DM：400，BA：420）用于 DAPI 染色。
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