10.1 血小板功能聚集功能（LTA法）检测
根据细胞学凝血模型理论，血小板在止凝血过程中起到关键的作用，血小板活化过程中的膜表面、释放的颗粒物等均对凝血过程有贡献。血小板除了止血功能外，也有很多其他的功能，比如参与炎症的调节、机体的免疫防御、伤口愈合、肿瘤生长和转移等。因此在临床活动中，对血小板功能性监测越来越重视。而我们在临床中对血小板功能的检测计数还不是很多，我们常用的是LTA方法测定血小板聚集率，TEG看血小板图，有的单位可以用流式细胞术做一些血小板标志物。这里主要详细介绍一下LTA的检测。TEG在其他章节中有体现。流式细胞术在后续中会作为一个问题展示。血小板的结构和功能见血小板相关章节。
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方法 |
标本类型 |
基本原理 |
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基于血小板聚集 |
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透射比浊法（LTA） |
枸橼酸化的PRP |
PRP是相对不透光的细胞悬液，血小板聚集后透光率增加，测定PRP样本透光率的变化可分析血小板聚集功能 |
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电阻抗法 |
枸橼酸化全血 |
利用电阻抗原理计数，检测不同诱导剂下血小板聚集情况 |
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基于剪切力的方法 |
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PFA-100/PFA-200 |
枸橼酸化全血 |
在高剪切率下，利用不同激活剂激活血小板，检测血小板聚集情况 |
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基于粘弹性试验的性质分析 |
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TEG |
枸橼酸/肝素化全血 |
利用物理学原理监测血块形成的过程 |
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ROTEM |
枸橼酸/肝素化全血 |
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SONOCLOT |
枸橼酸化全血 |
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基于血小板表面标志物的测定方法 |
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流式细胞术 |
枸橼酸化全血/PRP |
使用已知抗体检测血小板表面标志物 |
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ELISA |
PRP |
检测血小板释放物：PF4、β-TG、P选择素等 |
10.1.1透射比浊仪（LTA）检测原理
LTA曾被认为是血小板功能检测的金标准。其原理为：富血小板的血浆（PRP）是相对不透光的细胞混悬液，加入诱导剂使血小板聚集后透光率增加，通过测定透光率的变化可以分析血小板的功能。PRP在各种诱聚剂作用下发生血小板聚集，悬浊度下降，透光率增加（贫血小板血浆PPP样本的透光率设定为 100%），因此 LTA 可实时测定血小板聚集的动态变化。
因为血小板可以被多种诱聚剂、在不同的浓度条件下激活，因此 LTA 检测的优点之一就是灵活性。血小板之间相互作用的动力学信息与血小板激活的不同阶段 （从血小板形态变化到释放颗粒、从不稳定的聚集到牢固聚集）相对应，这些动态变化可由电子显微镜观察确认。
LTA 是一种相对非生理条件的试验：需从全血中分离血小板；低剪切力搅动；需加入诱聚剂才产生聚集。这些试验条件不能完整模拟血管壁损伤导致的血小板粘附、活化和聚集过程。
10.1.2常用的诱导剂
其中属于强诱导剂：胶原、凝血酶、TXA2、直接诱导血小板聚集、TXA2合成和血小板颗粒分泌。弱诱导剂：ADP、肾上腺素，诱导血小板聚集，无释放反应。
10.1.3 LTA法血小板聚集功能检测图形（光学比浊法检测血小板聚集标准化专家共识）
LTA法血小板聚集功能检测图形可提供报告参数和图形参数，报告参数直接由仪器通过聚集过程中浊度信号的变化规律获得并描记，图形参数需要操作人员结合聚集波形图进行确认，具体参数意义如下：①最大聚集率（%）：用于判断有无聚集。测量最大聚集时距PRP基线的高度（h1）及PRP基线与PPP基线间的高度（h0），按下列公式求得血小板最大聚集率（MAR）：MAR=（h1/h0）×100。②二相聚集：显示不可逆性聚集（胶原、花生四烯酸、瑞斯托霉素不产生二相聚集）；如果用高浓度的诱导剂也不产生二相聚集，一般考虑血小板释放功能异常或者服用了抗血小板药物（如阿司匹林、P2Y12受体抑制剂）。③解聚：达到一相聚集后，未发生血小板释放反应，聚集的血小板散开。④形态变化：添加诱导剂后，因ADP、胶原蛋白等的产生，血小板立即产生形态变化。
一项聚集：血小板与外源性诱导剂接触后即发生聚集称第一项聚集，它与GPⅡb/Ⅲa和Fbg的相互反应有关，发生迅速，是可逆的聚集。
二相聚集：第一相聚集诱导血小板活化，血小板结构发生变化，释放出ADP等内源性致聚剂，加剧血小板聚集，称为第二相聚集，又称次级聚集，如血小板释放反应有缺陷，第二相聚集减低，发生缓慢，是不可逆聚集。
下图是一系列罕见血小板缺陷的血小板聚集试验示例图
10.1.4患者准备
10.1.4.1采血前准备：受试者应空腹，采血前一餐宜避免进食高脂食物；采血前2 h内禁饮咖啡或含咖啡因饮料，采血前30 min内禁止吸烟；同时，建议患者采血前2 h内避免剧烈运动。
10.1.4.2药物或膳食成分影响：①应在采血前完成由护士或患者所在科室记录受试者服用的所有药物，在解释血小板聚集结果时，临床检验实验室应考虑这些药物对血小板功能的影响；②可能影响血小板聚集率的药物：如阿托品、氢化可的松、阿司匹林、双嘧达莫、肝素、双香豆素、普萘洛尔、呋塞米、β内酰胺类抗生素等药物，以及丹参、红花、三七、银杏叶、水蛭类等中药制剂。③可能影响血小板聚集率的膳食成分：包括水溶性番茄浓缩物、可可黄烷醇、维生素E、鱼油等。
10.1.4.3应注意年龄、经期、妊娠等生理因素对血小板聚集的影响。
10.1.5标本采集
血小板实验的血标本采集应采用以下预防措施，以减少或避免血小板活化。
10.1.5.1.血液标本采集：①血标本采集应由经验丰富的医护人员操作，肘前静脉采集，不得拍打采血部位；不宜使用止血带，如需使用止血带，在针插入血管见回血后应立即释放止血带；采血过程不超过1 min。②血标本采集应使用19~21 G针头。③血标本采集应使用塑料或硅化玻璃管， 可使用真空管或注射器。
10.1.5.2血标本抗凝：①血标本使用105~109 mmol/L枸橼酸钠缓冲液抗凝，使得在处理和检测期间保持pH值稳定（正常范围6.8~8.5）。②血细胞比容（Hct）在25%~55%时，109 mmol/L枸橼酸钠与血液比例为1∶9，Hct过高或过低者应对抽血量进行调整，建议参考以下公式：抗凝剂的用量（ml）=0.185×全血量×（1-Hct）。
10.1.5.3血小板功能检测血样宜选择收集的第2管血，如患者本次采血只行此项检测则建议弃去第1管血，不建议采用血管通路采血以免外源肝素影响。
10.1.5.4使用不同抗凝管采血时，先采集枸橼酸钠管，然后采集EDTA或肝素管。
10.1.5.5在采集血标本之后，立即将抗凝管轻轻颠倒混匀，至少6次；不应过度混合或搅拌。
10.1.6标本的转运和保存
10.1.6.1血标本管应保持直立、加盖置于室温（20~25 ℃）保存，不应置于冰上、冰箱或水浴箱内。
10.1.6.2血标本不应通过气动管道系统运输。
10.1.6.3血标本在采血后4 h内完成测试。
10.1.6.4实验室应拒收存在凝血、严重溶血和采集超过4 h的血标本，并记录；如有脂血等，最终报告时应备注。
10.1.7样本准备
10.1.7.1离心机：应采用水平式低速离心机，运行稳定无震动，制动平稳。
1.1.7.2PRP制备：采用低速水平离心机在200 g的相对离心力下离心10 min得到PRP。建议PRP中血小板浓度至少应>150×109/L（随检测系统的不同，离心力、离心时间的要求也可不同）。
10.1.7.3PPP制备：在1 500 g的相对离心力下继续离心15 min得到PPP，建议PPP中血小板浓度低于10×109/L（随检测系统的不同，离心力、离心时间的要求也可不同）。
10.1.7.4PRP和PPP的转移：取样针或移液器应在血浆高度的1/2以下位置，吸取足够本次测试所需的PRP和PPP血浆，不要触及白膜层及红细胞。
10.1.7.5PRP和PPP存放：PRP应存放在塑料或硅化的玻璃材质的样本管中。
10.1.7.6100%聚集率浊度参照物：可采用PPP或其他等效物（其吸光度应尽量接近乏血小板血浆）。
10.1.7.7样本质量：确认离心后的血浆不应有溶血、黄疸及乳糜等浑浊物质，否则将影响检测结果。
10.1.8参考区间说明
检验结果的参考区间是有属性的。它是依赖于该项目的检测系统内设要素和标准不同而有变化的。根据临床诊疗目的不同，需应用不同种类和浓度的诱导剂。因检测系统、诱导剂的种类及浓度不同，最大血小板聚集率的参考区间有显著差别，各实验室应根据检测体系建立本实验室的参考区间；任意条件的改变都会造成现行参考区间的不适用。
在实验条件与厂家提供的条件（仪器、耗材、诱导剂及浓度）完全一致的情况下，实验室可参照厂家提供的参考区间，以20份正常人标本验证其有效性通过后，即可用于本实验室。
如实验室改动了任一条件，如诱导剂浓度、诱导剂生产厂家、配制方式等，需自行建立本实验室在该条件下的参考区间，具体参照《WS/T 402-2012：临床实验室检验项目参考区间的验证》
10.1.9报告方式
检验报告内容至少（可不限于）包括：检验项目、诱导剂种类、诱导剂的终浓度、参考区间、检验结果。如特殊病例，临床医生注明需要血小板聚集波形图时，应予提供。
10.1.10报告解读
10.1.10.1血小板聚集率减低
辅助诊断先天性及获得性血小板功能障碍；监测抗血小板功能治疗的效果；评价膳食及营养补充剂对血小板聚集功能的影响；手术患者出血风险评估。这些情况往往伴随血小板功能下降。
10.1.10.1.1辅助诊断先天性及获得性血小板功能障碍：先天及获得性血小板功能障碍是临床常见的出血性疾病，伴有血小板聚集功能减低，主要实验室表现为对一种或多种诱导剂诱导的血小板聚集率减低。巨大血小板症对瑞斯托霉素聚集率降低，对其他诱导剂反应正常。血小板无力症对瑞斯托霉素外所有的诱导剂均不聚集。低浓度瑞斯托霉素诱导的血小板聚集增高对2B型血管性血友病（vWD）和血小板型vWD的诊断具有特异性。储存池病或颗粒缺失（δ颗粒缺失等）表现为二相聚集缺失甚至发生解聚。
10.1.10.1.2监测抗血小板治疗的效果：抗血小板药物是一组能抑制血小板活化、聚集和阻止血小板参与血栓形成的药物，多用于心脑血管疾病、微血管病变、病理产科（先兆子痫、复发性流产等）等血栓相关性疾病的预防和治疗。通常应用LTA法动态监测评估抗血小板治疗效果，应注意不同浓度诱导剂检测结果与安全范围存在差异。
阿司匹林抑制血栓素A2合成，可选择花生四烯酸作为诱导剂。P2Y12受体拮抗剂（氯吡格雷、噻氯吡啶、普拉格雷、替格瑞洛），可选择二磷酸腺苷（ADP）作为诱导剂。血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂（替罗非班、拉米非班）抑制血小板聚集最终通路，导致除瑞斯托霉素外的诱导剂聚集率降低。丹参类、红花类、银杏叶类、三七类等中成药也可抑制血小板聚集。
10.1.10.1.3评价膳食及营养补充剂对血小板聚集功能的影响：水溶性番茄浓缩物可抑制ADP和胶原诱导的血小板聚集，可可黄烷醇可抑制肾上腺素诱导的血小板聚集，鱼油可抑制胶原诱导的血小板聚集。
10.1.10.1.4抗血小板治疗患者手术风险评估：抗血小板治疗可导致出血并发症，进行抗血小板治疗的患者在手术前，使用LTA法监测血小板功能，防范术中和术后的出血风险。对择期手术患者，血小板功能恢复正常有助于减少手术相关的出血。急诊手术根据患者用药史选择相应处理措施。
10.1.10.2血小板聚集率增高
仅有临床参考价值，多见于高凝状态和血栓性疾病，如冠心病、急性心肌梗死、人工瓣膜置换后、经皮冠状动脉介入术后、先天性心脏病、脑梗死、深静脉血栓形成、糖尿病、胰岛素抵抗、高同型半胱氨酸血症、高β脂蛋白血症、复发性流产、先兆子痫、抗磷脂综合征、特鲁索综合征、口服避孕药、吸烟、缺乏运动等情况，显示对ADP、花生四烯酸、胶原、凝血酶等诱导剂作用下的血小板聚集率增高。血小板功能结果易受检验前、中后等多种因素影响，建议对异常结果进行复查，不能根据1次检测结果，即行诊断。
10.2基于粘弹性的试验（Sonoclot简介）-TEG在其他章节有详细介绍
10.2.1检测原理：与超声波传感器相连的一次性塑料探针在新鲜为抗凝的血液标本中以200Hz的频率上下震动，所遇到的阻力被记录下来，转换为模拟信号，以凝血信号（clot signal）的方式由电脑或打印机显示出来，其实质是血液标本整个凝固过程中粘弹性变化实时监测。
10.2.2参数意义
ACT（激活凝血时间）是血液保持液态的时间，正常值为85-145s，主要反应内源性凝血激活的情况。CR（凝血速率），曲线上升第一个斜率，反应纤维蛋白形成的速率，间接反应纤维蛋白原的水平，正常值15-45clot signal/min。
TP（time to peak达到高峰时间），凝血信号曲线达到高峰的时间，该高峰由纤维蛋白与血小板相互作用形成，可反应纤维蛋白原水平及血小板量和功能，正常值＜30min。MCS（最大凝血标记值）代表探针遇到的最大阻力值，其高度反应凝血收缩的强度，正常值70-90clot signal。RF（血小板功能），反应血小板功能，由分析仪相连的电脑软件根据血液标本结束液态阶段后凝血收缩的强度和速度计算出来的相对值。
正常的Sonoclot曲线通常可见两个明显的高峰，第一个反映了纤维蛋白原转变为纤维蛋白，其上升支越陡（CR值越大），说明纤维蛋白原的浓度越高，其变成纤维蛋白的速度越快，第一个高峰以后的曲线下降至第二高峰形成及其后的下降支是纤维蛋白与血小板相互作用，血块收缩。
第二高峰越高、越陡。说明凝血块收缩越强烈，纤维蛋白原浓度越大，血小板参与凝血的综合体现越好。
10.2.3临床应用简介：Sonoclot作为一种粘弹性实验，其和TEG有着类似的作用，与其他凝血项目一起在临床中发挥其不同的作用。Sonoclot在抗凝管理、围手术期凝血的监测、DIC的辅助诊断和高凝状态的识别起着重要的作用。而且由于用血量很少（0.36ml），因此在儿科中（婴幼儿）的作用更大一些。
10.3PFA-100/200简介：血小板功能仪是微处理控制的仪器，它可定量测定高切变力下血小板和血小板的止血功能。该实验过程为0.8ml枸橼酸抗凝血加到一个装有一次性实验管的槽内，预温37℃，然后利用真空吸力使血样通过一个直径200微米的不锈钢毛细管和直径为150微米的硝酸纤维膜微孔，膜上包被胶原蛋白和肾上腺素（CEPI）或胶原蛋白和ADP（CADP），在5000-6000/s的高切变力和诱导剂作用下血小板产生聚集，阻碍血液通过微孔，堵塞微孔的时间为终止时间（CT）。CEPT管CT时间延长，可能为严重的遗传性血小板功能缺陷（如贮存池病）和阿司匹林抑制。CEPT管和CADP管CT值都延长，可能为严重的遗传性血小板功能障碍（如Glanzmann血小板功能不全和Bernard-Soulier综合症）和VWD。因此可以检测血小板黏附、聚集、栓子形成的初期止血障碍相关疾病、血栓前疾病、GPⅡb-Ⅲa拮抗剂等抗血小板药物监测、血小板贮存、VWD及DDAVP治疗、肝肾功能疾病等。
10.4流式细胞术在血小板功能检测中的应用
随着科技的发展，流式细胞术在血小板相关检测中越来越受到重视，所测定的项目也是越来越多。正常人血小板一般处于静息状态下，大概血小板活化，其表面的膜蛋白发生显著变化，这些变化成为活化血小板的检测标志物，其表面活化物通过免疫法测定的可分三类：①血小板颗粒膜上的糖蛋白，如CD62、CD63在膜上表达，称为活化血小板的分子标志物。②是血小板膜表面变化的糖蛋白表位，如GPⅡb/Ⅲa的PAC1表位，其仅在血小板活化时候表达。GPⅣ（CD36）虽然在静息状态下也表达，但活化后表达显著增高。GPⅠ b-Ⅸ-Ⅴ复合物（CD42）则相反，在活化表面显著降低。③出现在活化血小板上能与血小板表面相结合的一些抗原。包括纤维蛋白原、Ⅹa和thrombospondin等，这些抗原在血小板表面的出现和消失在检测中有其重要临床意义。
10.4.1流式细胞术在血栓疾病中的作用
血栓性疾病初期，血小板被激活活化，其活化的标志物可以用FCM检测出来，比如，抗GPⅡb-Ⅲa单克隆抗体、抗P-选择素（GMP-140）单克隆抗体、抗53kD溶酶体单克隆抗体及抗110kD溶酶体单克隆抗体在血小板活化时结合增加，而抗GPⅠ b-Ⅸ单克隆抗体结合降低。此外研究发现，P-选择素和纤维蛋白原结合能力可作为血栓性疾病实验室诊断的可靠方法。
10.4.2流式细胞术在出血性疾病的作用
ITP为自身抗体破坏血小板所致的出血性疾病，血小板表面的免疫球蛋白（血小板相关免疫球蛋白，PAIg）增加，在FCM上表现为阳性细胞百分比与荧光强度增加。此外用FCM还发现了ITP患者血液中含有较多的血小板微粒（PMPS：血小板活化后产生的膜碎片，含大量磷脂成分，后者有促进血液凝固的作用）。
10.4.3流式细胞术在遗传性出血性疾病中的作用
血小板无力症为GPⅡb-Ⅲa复合物质或量的缺陷引起血小板聚集异常，利用抗GPⅡb-Ⅲa单克隆抗体在FCM上检测GPⅡb-Ⅲa比传统方法更快速准确。
巨血小板综合症（BSS）是因GPⅠ b-Ⅸ复合物缺陷所致的血小板功能异常，应用抗GPⅠ b抗体与GPⅨ单克隆抗体在FCM上直接测定GPⅠ b-Ⅸ复合物更准确的反应其量的异常。
贮存池病系血小板中致密颗粒缺陷引起的遗传疾病，用FCM更快速准确。
血管性血友病为vWF异常，利用抗vWF单克隆抗体结合试验，在FCM上观察vWF与GPⅠ b结合情况，可为血管性血友病提供诊断依据。
10.4.4抗血栓药物的监测
一些新的抗血栓药如c7E3 Fab（嵌合抗体7E3的Fab片段）、合成多肽、Kistrin等，能阻断GPⅡb-Ⅲa的功能，活化血小板检测可监测这类药物的作用，避免发生毒副作用。
10.4.5血小板的储存与输注
用P-选择素（CD62）、CD63、GPⅡb-Ⅲa作为分子标志物，可发现血库中储存血小板有时间依赖的活化现象。
10.5Verify Now分析仪简介
枸橼酸全血加入诱导剂TRAP（凝血酶受体活性肽），使血小板与纤维蛋白原珠凝集时透光度增加，凝集程度与透光度成正比。结果以Mv/10s表示。其特点是速度快，简便，能准确的检测目前市面三大类【环氧酶-1（阿司匹林）相关血小板聚集功能检测。P2Y12受体相关血小板聚集功能检测（氯吡格雷。替格瑞洛等）。GPⅡb-Ⅲa检测（阿昔单抗、替罗非班、埃替非巴肽等）】常用抗血小板治疗药物对病人个性 有效性。
小结：血小板在凝血中的作用很多，上面仅仅介绍了几个我们常用的检测项目。对于血小板的释放功能，也有很多项目可以检测，比如TXA2等代谢物的检测就不在这里叙述了。有需要的会在后续的知识点中作进一步的介绍。综合判断，联系临床还是血凝中最重要的问题。
资料来源：血栓与止血基础理论和临床；临床出血与血栓性疾病；全国检验操作规程第四版；百度百科；公众号：血栓与止血百家争鸣、凝血图说、天山医学院、网络讲座，光学比浊法检测血小板聚集标准化专家共识、symex公司资料和网络搜索，版权归原作者所有，如有侵权请联系本人删除，如需要全文引用请备注来源，谢谢！
