（司法兰亭会九周年，感谢南开大学法学院校友安尧题字）
程俊峰 | 北京高朋律师事务所高级顾问；在某部委从事多年计算机和互联网相关违法犯罪治理工作；曾在某美股上市互联网公司负责数据合规工作。
编者按：
此为作者完成于2001年的中国人民公安大学诉讼法学硕士毕业论文。浏览后发现，此项技术在混合检材检验、一些特殊的单亲亲子鉴定、人类群体遗传研究及其在法医学检验的运用，具有很高的价值。
从文末的两个疑难案例的解决，也能让我们管窥其威力：
“2001年4月，河南某县送检一份强奸案检材，为受害人阴道拭子。二步法消化后采用AmpFISTR Profiler Plus试剂盒扩增，得到的基因分型信息很杂，女性DNA较多，难以得到准确的男性基因分型信息。我们采用四个Y-STR基因座复合扩增对一步消化的检材进行扩增，得到了清晰的分型结果，得出了结论：不能排除嫌疑人李某。
2001年4月，山东某县公安局送检一起强奸致孕案，检材为男性引产胎儿肌肉组织及5名嫌疑人和受害人的的血样。我们采用四基因座的Y-STR复合扩增系统进行检验，得到了清晰的结果，排除了四名嫌疑人，不能排除嫌疑人阎某。经常染色体STR检验（AmpFISTR Profiler Plus试剂盒），结果证实嫌疑人阎某为胎儿的生物学父亲。”
当然，作者也反复强调，今天，这些技术及其相关发展已经高度发达，因此，建议不推送。但我认为还是很有开创价值，所以坚持推出，主要是一起来感受理性科学研究和实证实验分析的魅力。
引言
技术的发展常常取决于实践的需要。STR技术的产生使得法医DNA检验技术实现了高度灵敏、微量、快速、自动化的飞跃，因此这一技术得到了非常广泛的应用，目前法医DNA常规检验工作几乎都是采用常染色体STR基因座复合扩增的方法。
但是，常染色体STR基因座检验并不能够解决法医DNA检验工作中的所有问题，因此目前各国法医遗传工作者常常关注于寻找一些其它的检验技术作为常染色体STR检验技术的补充，以求解决常染色体STR检验无法解决或解决起来较为困难的问题。
其中，混合检材的检验问题就是一个困扰法医遗传学界多年的的问题，在利用常染色体STR基因座检验混合检材时常常无法获得理想的结果。
这是因为我们目前采用的两步法分离混合检材DNA的方法常常无法彻底地将女性DNA分离，同时分离时易造成男性DNA的丢失，加之这种方法只是对于强奸案件中的混合斑有用，无法对血-血等混合样品进行检验。
因此寻找一种更加适用于混合检材检验的方法就成为了当前摆在各国科学家们面前的一个迫切的问题。
在这方面，Y染色体由于它的男性特异性特点使得它有可能成为解决混合检材检验问题的一种很好的方法因而引起了法医遗传学家们的关注。
近年来，Y染色体STR基因座的研究成为了法医遗传学领域内的一个研究热点，越来越多的定位于Y染色体的STR基因座被发现、报道并应用。
本文作者对最近报道的四个Y-STR基因座在中国汉族及广西壮族人群中的分布以及其在法医检验实践中的应用价值进行了调查研究，希望能够对Y染色体STR基因座检验在我国的应用积累初步的的资料，做出一份贡献。
本论文共约两万九千余字，分为五大部分。
第一部分Y染色体法医DNA检验概述，主要论述了DNA检验、STR基因座的应用历史、Y染色体的特点及其与STR基因座结合起来应用于法医个人识别的优点。
第二部分材料与方法，主要介绍了进行实验研究所用的仪器试剂和操作步骤。
第三部分结果与分析，主要通过各种图表将我们的实验结果进行了直观的表述，同时还运用统计学方法对数据进行了分析比较。
第四部分讨论，主要根据我们得出的数据、结果进行分析与讨论，同时通过实际检验中的应用分析了这四个Y-STR基因座在实践中的应用价值。
第五部分结论，对实验中得出的这四个Y-STR基因座的一些特点进行了总结，同时也指出了实验中存在的一些不足。
一、Y染色体法医DNA检验概述
（一）DNA分型技术的法医学应用及其发展简介
法医生物物证检验就是要通过各种方法对与案件有关的生物检材进行检验以获得足够的能够用于个人识别和亲子鉴定的信息，从而获得有助于了解案件真实情况、解决各种纠纷的有力证据。
古代就有一些生物检材被用于检验。其中最常见的就是血液了，它经常被用来进行亲子鉴定，但方法却都没有什么科学性，所谓滴骨验亲、滴血验亲都具有十分浓厚的迷信色彩。
1900年，landsteiner发现了ABO血型，1902年ABO血型系统被应用于个人识别，从而开创了科学的法医物证检验时代。随后，免疫技术的广泛利用使得血型系统检验技术有了较大的发展，发现了多种可以应用于法医物证检验的血型系统，如：MN、Rh、P、Lewis、Kell等。
到了本世纪50年代，电泳技术的应用，使得酶型检验的方法得以应用于法医物证检验，大大地提高了个体识别能力。但是，这些停留在蛋白质水平上的检验技术始终不能够达到同一认定的水平，这就极大地限制了生物物证在案件侦查和法庭证明中应有作用的发挥。这种情况一直持续到DNA检验技术的出现。
1985年，英国莱斯特大学遗传部主任Jefferys教授在著名的《自然》杂志上报道了一种新的法医物证检验技术—DNA指纹图（DNA Fingerprnt）。并首次利用这一技术解决了一起移民争端案件，使法医物证检验技术达到了DNA分子水平，实现了从只能排除到同一认定的飞跃。从此法医物证检验技术进入了DNA检验时代，在短短十几年里取得了突飞猛进的发展。
众所周知，人类基因组序列99%以上是完全相同的，只有不到1%是不同的，正是这不到1%的差异造成了不同人种、不同个体间的如此巨大的差异。因此我们可以从DNA分子水平上来检测这些差异，从中获取足够用于个体识别的遗传信息实现法医物证检验的目的即个体识别（或亲子鉴定）。当然，用序列测定的手段来对整个基因组进行测序找出所有差异序列是最为可靠的方法了。但是，这是一项浩大的工程，将其用于法医学鉴定是不现实的。
因此，人们纷纷寻找更为简便的检测手段并通过这些手段对人类基因序列中等位基因多、多态性较好的基因座进行检测，力求用快速灵敏的检测方法检测尽量少的差异基因座而能够达到同一认定的要求。
从检测手段来说，最先是苏格兰爱丁堡大学的E.M.Southern所创立的印记杂交技术（Southern bolt）,通常也称为限制性片断长度多态性（RFLPs）分析,Jefferys的DNA指纹技术就是采用了这一检测技术。它是通过酶解得到具有个体差异性的DNA片段。并将电泳后后的DNA片段经变性后通过毛细作用从凝胶上转印到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用带标记的DNA探针与之杂交达到检测目的。
1985年，美国CETUS公司的Kary Mullis开发出了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）利用DNA聚合酶通过引物与模板的特异性结合从而大量复制出我们所需的特异性片断，根据扩增片段大小差异进行个人识别和亲子鉴定。
1989年耐热DNA聚合酶—Taq酶的开发成功使得这一技术实现了自动化，迅速地在全世界得到了更为广泛的应用。PCR技术结合聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染检测在法医DNA检验中的应用，使我们获得了一种高灵敏度、高特异性的检测方法，解决了DNA指纹图无法解决的微量检材的检验问题，极大地推动了法医物证检验技术的发展，被称为第二代DNA检验技术。另外DNA序列分析技术在解决一些特殊检材检验问题时也得到了较为广泛的应用。
从所检测的DNA差异来看，主要有两大类，一类是长度多态性，另一类是序列多态性。在人类基因组中存在着一些重复序列，其中有些重复序列是串联排列的，这些重复序列由于重复单位重复次数不同而造成片段大小的不同，在人群中表现出差异性，这就是所谓的可变数目串联重复序列（VNTRs），又叫做卫星DNA，属于DNA长度多态性。
我们根据其核心重复序列的大小不同，可以把这些卫星DNA分为经典卫星（大卫星）DNA、中卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA。其中在法医遗传学检验中应用较多的是小卫星DNA和微卫星DNA。小卫星DNA的核心序列长度在15—70bp间，重复片段长度在几kb到约20kb，微卫星核心序列长度为1-7 bp，重复片段长度在500 bp以下。
最初DNA指纹图所采用的DNA多态基因座是小卫星DNA，而目前应用最多最为普遍的就是微卫星（STR）DNA了。而DNA序列多态性在法医物证检验中也有着很重要的应用，目前主要是对线粒体D环区的大约1200碱基对的高变区进行检测，主要应用于一些细胞核DNA已降解或没有细胞核、无法对核DNA进行检测的检材，如毛发的毛干部份、陈旧的骨骼和牙齿等。
从当前世界各国法医DNA检验技术的应用情况来看，绝大多数都是利用PCR反应复合扩增多个STR基因座从而获得足够的遗传信息。此外还有随机扩增多态性 DNA（RAPD）、小卫星重复单位别型作图（MVR）等技术，但由于种种原因都没有得到广泛的应用。
近几年来，由于荧光标记引物结合测序仪自动检测的应用，使得STR-PCR技术实现了检测的自动化、结果的数字化，从而极大地推动了STR-PCR技术发展和以它为基础的DNA数据库的建立与应用。同时，通过序列测定技术检测线粒体DNA高变区多态性，已经成为检验一些特殊检材的必不可少的手段了。
由于生物技术的发展，目前DNA芯片、通过DNA推断人的生理特征等技术也逐渐开始应用于法医DNA检验，随着人类基因组计划的进展和基因时代的到来，法医DNA检验技术必然会取得更大的成功。
（二）STR基因座的特点及其在法医学中的应用优势
1、STR分型技术的研究及应用历史
STR是短串联重复序列（short tandem repeat）的缩写，也叫做微卫星DNA（microsatellite DNA），也有叫做简单重复序列的（simple sequence repeat，简称SSR）。它是目前法医遗传学界应用最为广泛的一类遗传标记。
人类基因组有很大一部分是DNA重复序列（约25%）。这些重复序列都是以一个核心序列重复不同次数而形成不同长度的等位基因。根据核心序列长度的不同我们把这些重复序列进行了分类。微卫星DNA即STR，它的核心序列长度在1—7bp间，扩增片段即等位基因大小在100—500bp之间。随着PCR技术在法医遗传检验技术中的应用，STR基因座广泛地应用于法医DNA分型，逐渐取代了DNA指纹技术，成为了目前世界上最为广泛的常规检验技术。
1988年Saiki等发现了STR基因座可以通过PCR反应扩增。1991年Edwards等发现STR基因座具有很高的多态性并可以进行复合扩增。1993年Wiegand等复合扩增12个STR基因座，累积识别率达到了同一认定的水平。1993年，国内学者在张家界召开的法医物证会议上首次报道了3个STR基因座（HUMTH01、HUMFABP、HUMARA）复合扩增在法医DNA检验中应用的情况。同年在意大利威尼斯举行的第15届国际法医血液遗传学会（ISFH）DNA委员会的国际会议上，对短串联重复序列的法医DNA分型检验提出了一些建议并规定采用核心序列重复数目命名STR基因座的等位基因。
1989年耐热聚合酶的发现推动了PCR技术的发展，使PCR技术进入了自动化、实用化阶段。此后，复合扩增STR基因座进行法医DNA分型技术得到了迅速的发展和普及，目前已被世界上大多数国家和地区的实验室作为常规检验技术。近几年来通过荧光标记引物扩增、DNA测序仪自动检测、计算机软件自动分型的STR基因座复合扩增检测技术的产生使得法医DNA检验技术实现了自动化、数字化，得到了更加广泛的应用。
2、STR基因座的特点及应用于法医DNA检验的优点
（1）等位基因片断长度较小，一般在100—500bp范围内，易扩增，适用于腐败检材的检验，克服了指纹图等技术对于检材质量要求高因而限制了现场物证作用的发挥这一缺陷。
（2）各个等位基因间大小相差小，扩增成功率高，灵敏度大大高于小卫星Amp—FLP系统，有效地防止了因小片断优先扩增造成错误判型的出现。因此，非常适合PCR反应，有效地解决了微量物证检验的问题。
（3）单个的STR基因座等位基因数虽然有限，但是STR基因座存在于整个基因组中，而且由于STR基因座的扩增条件可以十分近似，因此通过复合扩增多个没有连锁遗传的STR基因座就可以获得极高的个人识别能力，足以达到同一认定的水平。所以，对于法医DNA检验来说，STR基因座是一个非常巨大的的遗传标记库，应用非常方便。
（4）荧光标记复合扩增STR基因座的法医DNA检验技术使得STR—PCR技术实现了自动化、数字化，检测更为灵敏，同时减少了人工操作，从而大大降低了失误的风险。最为重要的是，计算机分型的数字化的检验结果适用于DNA数据库的建立和应用。
总之STR基因座所具有的其他遗传标记所不具备的一系列优点，使它获得了世界各国法医遗传专家的青睐，在世界范围内得到了极为广泛的应用，成为当前的主流技术。STR—PCR技术被称为第二代法医DNA检验技术，甚至有许多人认为，这一技术的出现使得法医DNA检验技术的发展进入了一个平台期，不会再有什么突破性的发展了。
（三）Y-STR基因座的国内外的研究情况及其在法医DNA检验中的应用
1、Y染色体短串联重复序列的国内外研究应用情况
短串联重复序列（STR）基因座有很多优点，因此在法医DNA检验中得到了广泛的应用，十几年来有许多STR基因座被报道并成功地应用于法医DNA检验中，但是，相对于常染色体，定位于Y染色体上的STR基因座却应用较少且主要用于性别鉴定，直到近年来情况才有了较大的改观，国内外部分学者进行了一些Y-STR基因座应用于个人识别的研究，取得了不少成果，并已初步地应用于实际案件检验。
最初研究定位于Y染色体上的遗传标记时，人们曾经认为Y染色体是缺乏多态性较好的遗传标记的。STR基因座的发现及应用改变了人们的看法。人们开始注意Y染色体特异的遗传标记。但是Y染色体上的遗传多态标记常常呈连锁遗传几个基因座联合概率不能通过独立基因座连乘的方法计算，且Y染色体上的STR基因座相对缺乏，与常染色体相比约为1：4。加之人们通过常染色体STR基因座的联合应用已经足以达到个人识别的目的了，所以Y染色体特异的STR基因座很少有应用于个人识别的。多态性较好的可以应用于个人识别的Y-STR基因座在90年代前半期只有很少的几个报道,例如DYS19、YCAⅠ、YCAⅡ、YCAⅢ等。
近年来，根据常染色体STR基因座进行个人识别的技术已经非常成熟了，但是在一些特殊问题上，例如混合斑检验或者缺少父亲样本的亲权鉴定，仅仅利用常染色体的STR基因座进行检验有时比较困难或是无法解决。各国法医DNA工作者开始注意到Y-STR基因座如能应用于个人识别在上述情况下会有常染色体STR检验无法比拟的优势，因此Y-STR基因座应用于个人识别的研究开始引起了专家们的重视，开展了一系列的研究并取得了一定的成果。
荷兰的P.de.Kniff是开展Y-STR基因座多态性研究较早的科学家。他和德国的M.Kayser等20余位各国科学家在1997年曾经联合进行了有关Y染色体上STR基因座多态性研究，调查了13个Y-STR基因座的多态性情况。他们采用荧光标记引物复合扩增的方法对来自欧洲、美洲、亚洲、非洲、大洋洲的48个不同人群的3825个无亲缘关系的男性个体进行了13个Y-STR基因座的等位基因分布频率和不同的单倍型频率及多态性调查。结果发现，DYS288、DYS388、DXYS156Y、YCAΙ等四个基因座的基因多态性很低，DYS391、DYS392、DYS393三个基因座为中等，DYS19、DYS390、DYS389Ι/Ⅱ、YCAⅡ高一些，而DYS385、YCAⅢ两个基因座较高。同时他们发现等位基因的分布在较大的人群中是有显著差异的，例如亚洲人群中片断较大的等位基因出现较多，而美洲人群中则是片断较小的等位基因出现频率较高。由于Y染色体上的基因为连锁遗传，所以只有通过实际调查统计得出Y染色体单倍型（YH）的分布频率才有实际应用价值。他们采用不同的Y-STR基因座组合来建立单倍型并进行了频率调查，共分为YH1、YH2、YH3、YH4等4组，其中YH1为DYS19、DYS390、DYS389Ι/Ⅱ、DYS391、DYS392、DYS393等7个基因座的组合，YH2为YH1+DYS385，YH3为YH2+ YCAⅡ，YH4为YH2+ YCAⅢ。
根据他们的调查结果可以发现：首先不同人群的单倍型（Haplotypes）多态性不同，识别能力（Discrimination capacity）也不同。例如YH1在70个德国个体中发现了63种单倍型，识别能力为90%，而在54个瑞士个体中发现了51个不同单倍型，区别能力为79.7% 。36个中国人中有34个不同单倍型，识别能力为94% 。同时，在同一人群中不同的单倍型多态性不同，采用基因座较多的单倍型多样性和识别能力都较高。例如，在70个德国个体中，YH1、YH2、YH3、YH4四种单倍型的不同单倍型数分别为63、68、69、70，识别能力分别为90.0%、97.1%、98.6%、100%。另外他们还进行了各个Y-STR基因座的突变率的调查，并得出了DYS19基因座的突变率为0.0032，而其他基因座由于样品数目不够大并没有进行计算。
此外还有许多法医遗传工作者在各自的国家进行了相关研究并取得了一定的成果。
对90年代中后期发现的几个多态性较好的Y-STR基因座，德国、日本、西班牙等国家的法医遗传科学家纷纷进行研究，获得了这些Y-STR基因座等位基因在不同人群中的分布频率并将之用于法医DNA检验实践中。例如：Christian等人采用荧光标记引物复合扩增结合测序仪检测的方法对瑞士人群中DYS19、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393等7个Y染色体特异的STR基因座进行群体调查获得等位基因的及单倍型（Haplotype）分布频率，得出这几个Y-STR基因座的GD（GeneDiversity）值分别为0.6116、0.5824、0.7449、0.7137、0.4849、0.6449 、0.4191，并对这几个Y-STR基因座在法医DNA检验中应用进行了探讨。1999年日本的Katsuya Handa等人报道了在一起强奸案的重审中成功地应用DYS19、DYS390、DYS393、YCAⅡ等四个Y-STR基因座对一份25年前的混合斑检材进行检验 。
在我国，也已经有一些法医DNA工作者对这几个应用较早的Y-STR基因座进行了研究.唐双柏等人调查了DYS19、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390等Y-STR基因座等位基因及单倍型在广州汉族人群中的分布频率及多样性。侯一平等调查了DYS19、DYS389、DYS390、DYS391、DYS393等五个Y-STR基因座的等位基因在成都汉族群体中的遗传多态性。
总之，近几年来，各国科学家纷纷展开了关于Y-STR基因座在法医DNA检验中应用的研究，但是多集中于90年代中前期发现的几个Y-STR基因座如DYS19、DYS389、DYS390等，而仅有这几个基因座对于法医DNA检验来说是远远不够的，因此发现新的Y-STR基因座、调查人群中等位基因的分布频率并进行法医学应用评估以建立高效的Y-STR检验系统就成为了Y-STR检验研究领域内最迫切的任务。1999年，P.Scott White等人报道了新发现的几个Y-STR基因座的引物序列、扩增条件、核心序列及初步调查的（35份样品）各基因座的基因多态性情况。
根据P.Scott White等人的报道，他们共筛选出了7个有着个体差异性的Y-STR基因座。分别命名为A4、A7.1、A7.2、A8、A10、C4、H4。它们的核心重复序列均为四个核苷酸（GATA）。各基因座发现的等位基因分别为4个、5个、5个、12个、4个、6个。其中，除A4、A8基因座在X、Y染色体上均有扩增产物外，其余均为Y染色体特异。
但是，A4基因座在X染色体上的扩增产物大于1kb，因此除A8基因座外，其余基因座均适用于建立Y染色体特异STR基因座法医检验系统。而在这6个Y染色体特异的STR基因座中，H4的等位基因片断接近400bp相对不易扩增，而其余5个基因座的等位基因片断大小均在100-300bp，更加适应法医DNA检验的要求。因此我们选择其中4个扩增条件相近的基因座（A10、A7.1、A7.2、C4），对其在我国人群中的等位基因和单倍型的分布频率进行初步的调查，并探索建立这四个基因座的复合扩增体系，以便建立一套高效的Y-STR检验系统。
2、Y染色体特异的STR基因座在法医DNA检验中的应用
人类23对染色体分为常染色体和性染色体1—22号染色体是常染色体，X、Y染色体为性染色体，其中Y染色体为正常男性所独有，而且它是单倍体，在细胞内只此一条，没有同源染色体，儿子Y染色体完全是由父亲遗传下来的。
同时Y染色体在减数分裂时除拟常染色体区外，均不发生重组，所以在不发生突变的情况下，父亲的Y染色体非重组区的特征将毫无变化地遗传给儿子。
正是由于Y染色体的这些独特的性质，使得Y-STR基因座分型在法医DNA检验中具有一些常染色体所无法比拟的独特优势。
（1）在混合检材检验方面
在法医物证检验中我们经常遇到混合检材，如精液和阴道分泌物组成的混合斑、混合血样等。特别是在强奸案件中，经常需要对精液—女性阴道上皮细胞的混合检材进行检验。对于这种混合斑的检验，我们通常采取二步法进行分离与检验。利用精子细胞外包膜具有丰富的硫醇蛋白交联结构因而耐受力较表皮细胞强的特点，首先通过SDS、蛋白酶K消化，裂解女性上皮细胞，经过离心等方法去除女性物质后再采用加入二硫苏糖醇（DTT）破坏精子细胞的硫醇蛋白交联结构，并结合SDS、蛋白酶K消化精子从而提取精子DNA。这种方法对于时间较久、精子含量少的检材常常有丢失精子DNA导致分型失败的危险。
同时，由于大多数情况下混合斑中的女性DNA较多难以彻底分离，经常导致干扰分型甚至无法正确分型的情况出现，而且，当女性DNA残留较多的时候，由于女性DNA的优势扩增还会导致含量较少的精子DNA无法得到有效扩增甚至无法扩增。此外对于轮奸案、血液与血液、血液与唾液等混合样品两步法就无能为力了。
由于Y染色体具有男性特异性的特点，所以它在进行男女性混合样品的检验时不需要对混合样品中的男女成分进行分离即可检测。这样不仅可以避免混合斑分离过程中男性DNA的丢失，而且还可以防止扩增过程中女性DNA的干扰。此外，在男性无精子的情况下，我们也可以通过这种方法对精液中的上皮细胞进行检验。
同时，对于无法用两步法进行分离从而无法用常染色体STR基因座进行检验的混合样品如混合血样等也可以应用这种方法进行检验。此外，在混合样品中的男性成分不止来自一人的情况下例如轮奸案中的混合斑，应用Y-STR基因座进行检验还可以确定混合成分提供者的人数。
(2)在亲权鉴定中的应用
前面已经提到Y染色体上除拟常染色体区外在减数分裂时均不发生重组因此父亲非重组区的遗传信息将毫无变化地遗传给儿子，所以我们可以通过比对父亲和儿子的Y-STR单倍型进行亲权鉴定。
同时由于Y染色体为父系遗传，所以在一些特殊的亲权鉴定案件有着独特的应用优势。如由于可疑父亲已经死亡或其他原因无法得到可疑父亲的样本时，我们就可以采集与可疑父亲Y-STR分型完全一致的其父系亲属如兄弟等的样品来代替可疑父亲的样本进行比对。
（3）应用于人类群体遗传研究
Y染色体的父系遗传特征使得它成为研究人类父系进化史以及了解群体遗传关系的一个有力工具。同时不同的人群中Y-STR单倍型的分布有着各自的特点，因此我们通过对各个不同人群中的Y-STR基因座单倍型的分布频率进行调查，可以得出不同民族、不同地区人群的Y-STR单倍型分布特点，在某些时候可以帮助我们推断犯罪人的种族或地区信息。当然这些信息的可靠程度有多高还取决于各种族和各地区人群中Y-STR基因座等位基因分布的特异程度。
而各地人群间的的交流越少，Y染色体特异的STR基因座等位基因在各人群中的分布就越有特异性，我们所应用的Y染色体特异的STR基因座越多，所获得的遗传信息特异程度就越高，也就越可靠。
因此，为了提高我们进行种族和地区推断的可靠性，很有必要寻找更多的Y染色体特异STR基因座并对更多的人群进行Y-STR基因座等位基因分布调查与比较研究。有些国外科学家提出，在大多数人类社会里，人的姓和Y-STR基因座一样，也是父系遗传的，因此他们认为在理想状况下，如果能够得到足够的Y-STR单倍型信息甚至可以推断出犯罪分子的姓。
二、研究材料与方法
（一）样品收集途径、要求及样品DNA的提取
1、样品收集：收集广西壮族无关男性个体血样100份以及浙江、福建、江西等地无关男子血样100份以备各Y-STR基因座的等位基因分布频率调查。
其中汉族血样为打拐案件检材中的剩余，壮族样品由广西省公安厅汪平、朱少健提供，两种血样均为滴于滤纸上干燥后的血斑。肌肉等组织样品、家系样品、混合斑检材等均由实际案件的检验中收集。
2、仪器与试剂：
超纯水器 （ Millipore公司）
PE480型DNA扩增仪 （PEKIN-ELMER Cetus公司）
恒温水浴一台
匀浆器
小型台式离心机 （ Heraeus 公司）
涡漩振荡器一台
5%的Chelex-100溶液（超纯水中加入Bio-RAD公司产分析纯Chelex- 100 5g至总体积100ml）
10mg/ml的蛋白酶K溶液
1mol/L的DTT溶液
10%的SDS
3、各种检材的DNA提取（均用Chelex法提取）
（1）血斑（滤纸上）或血液的DNA提取步骤与方法：
①剪取约0.1cm2的血斑或取4µl的血液置于0.5ml离心管中，加入500µl超纯水室温下浸泡10-20分钟，不时颠倒振荡。
②13000转/分钟高速离心5分钟后去掉上清，保留载体。
③在沉淀中加入500µl超纯水，洗沉淀，13000转/分钟高速离心5分钟后去掉上清，重复1-2次，直至上清液不再是红色或红色较浅。
④加入200µl5%的Chelex-100溶液悬浮沉淀，置于PE480型DNA扩增仪中，调节温度至56℃，保温30分钟。
⑤取出离心管剧烈振荡10sec，于扩增仪中100℃变性8分钟。
⑥取出离心管剧烈振荡10sec，13000转/分钟高速离心3分钟后置于4℃下保存备用。
（2）肌肉及内脏等组织
①剪取约2mg的组织块置于0.5ml离心管中，加入生理盐水清洗一到两次。
②将组织转入匀浆器中研磨，加入超纯水浸泡，高速（13000转/分钟）离心5分钟，收集沉淀的细胞团块。
③收集的细胞团块处理方法同血斑。
（3）毛发样品（带毛囊）
①剪取毛发带毛根的部分5-10毫米置于0.5ml离心管中。
②加入5%的Chelex-100溶液200µl和2µl10mg/ml的蛋白酶K，于PE-480扩增仪中56℃保温过夜（至少6-8小时）。
③取出离心管，剧烈振荡5-10sec，于PE-480扩增仪中100℃加热变性8分钟。
④剧烈振荡5-10sec，13000转/分钟离心3分钟。
⑤4℃保存备用。
（4）混合斑样品
①取适量的混合斑样品剪碎，放入1.5 ml离心管中。
②加入1ml超纯水，然后加入10mg/ml的蛋白酶K10µl，10%的SDS100µl。恒温水浴中37℃保温2-4小时，以裂解女性上皮细胞。
③13000转/分钟高速离心8分钟，取出上清液4℃保存，以备女性DNA扩增反应。
④将检材转移到底部有孔的0.5ml离心管中，下接原1.5 ml离心管套管离心，去除载体。
⑤加入超纯水重悬沉淀物并将之转移至0.5ml离心管中，加入超纯水离心漂洗两次，得沉淀物。
⑥向沉淀物中加入200µl5%的Chelex-100溶液，吹打混匀，再加入10mg/ml的蛋白酶K溶液2µl和1MDTT溶液7µl，于扩增仪中56℃保温6-8小时。以下处理同血液。
（5）骨骼样品（较为新鲜）
①取骨骼样品洗净，晾干。用手术刀刮净表面。
②用钢锯锯开骨骼，取出一定量的骨松质置于0.5ml离心管中。
③加入200µl5%的Chelex-100溶液，10mg/ml的蛋白酶K10µl和7µl1M的DTT溶液，置于扩增仪中56℃保温过夜（8小时以上）。
④以下保温处理同血液。
（二）引物序列的合成及标记要求
参照P.Scott White等人报道的引物序列委托上海生物工程公司合成，根据片段大小不同将各基因座引物1的5’端标记不同的荧光颜料,Y-STR基因座A10、A7.1、A7.2、C4的引物序列如表1。
（三）目的DNA片段的扩增
1、仪器和试剂：
PE9600型或9700型DNA扩增仪（PEKIN-ELMER公司）
Biofuge台式离心机（Heraeus公司）
金牌耐热DNA聚合酶（Taq Gold ，PEKIN-ELMER公司）
稀释为2µmol/L的四对引物
Promega公司产10倍扩增反应缓冲液—Gold ST*R 10 xBuffer（内 含500µmol/L KCL，100µmol/L Tris-HCl（Ph8.3），15m mol/L MgCl2，1% Triton X-100，1600µg/ml BSA，2mmol/L的各种dNTP）
无菌去离子水
2、扩增体系
采用10µl扩增体系进行扩增成分如下：
10倍Gold ST*R Buffer 1µl
稀释好的2µmol/L的一对引物 1µl
5U/µl的金牌DNA聚合酶（Taq Gold） 0.2µl
模板DNA 1µl
无菌去离子水 6.8µl
3、循环参数
经过我们的摸索，各基因座的基本扩增循环参数如下：
（1）95℃ 11分钟 （启动金牌酶）
（2）94℃ 30 秒 （模板变性）
56℃ 30 秒 （引物退火）
72℃ 30 秒 （延伸）
以上变性、退火、延伸三步共35个循环。
（3）60℃ 45分钟 （延伸）
（4）4℃ Forever （保存）
4、复合扩增
（1）扩增体系：
仍采用10µl体系，成分如下：
10倍Gold ST*R Buffer 1 µl
5U/µl的金牌酶（Taq Gold） 0.2 µl
模板DNA 1 µl
A10引物（2µmol/L） 2 µl
C4 引物（2µmol/L） 0.4 µl
A7.1引物(2µmol/L) 1 µl
A7.2引物（2µmol/L） 0.9 µl
无菌去离子水 3.5 µl
（2）循环参数
各循环参数基本与单个基因座扩增的参数相同，只是为了保证四个基因座的引物都能结合到模板上，我们将退火温度降至51℃。
（四）扩增产物的检测
采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合全自动DNA测序仪检测扩增产物。
1、仪器与试剂：
ABI377自动DNA测序仪（PEKIN-ELMER公司）
9600型DNA扩增仪（PEKIN-ELMER公司）
Labfuge-400 台式离心机（Heraeus公司）
超纯水机（Millipore公司）
尿素（上海生物工程公司产）
10倍TBE缓冲液（pH8.0 含0.9M Tris,0.9mol/L boric acid,0.01 mol/L EDTA）
50%丙烯酰胺溶液（lang ranger gel solution，Acr：Bis=19：1，FMC公司）
10%的过硫酸铵（APS）
四甲基乙二胺（TEMED）
95%的甲酰胺溶液
葡聚兰
GeneScanRox-500内标（internallane standard，PEKIN-ELMER公司）
2、步骤与方法：
（1）凝胶的配制：采用7M尿素、5%的变性聚丙烯酰胺凝胶
①清洗玻璃板：用滤纸将上面的凝胶轻轻沾去（切勿用力以防凝胶年在玻璃板上），用自来水将玻璃板冲洗干净至无凝胶微粒残余，再用去离子水冲洗玻璃板两次。在此过程中要特别注意玻璃板特别是检测口的洁净，以防灌胶不匀或影响检测。SPACER和梳子也要清洗干净。
②配制凝胶液（30ml）：取一干净的小烧杯向其中加入成分如下：
尿素 10.8克
50%的丙烯酰胺溶液 3ml
10倍的TBE 3ml
去离子水 15.6ml
混匀，静待尿素溶解，也可以将烧杯拿在手中以利尿素的溶解。
③灌制凝胶：采用玻璃板平推法进行灌制。将未磨槽的那一块玻璃板平放于水平支架上，放好SPACER（可以在其上涂一些去离子水，以便与玻璃板吸附，避免推动时滑动）。在配好的凝胶液中加入聚合剂TEMED 15µl，催化剂10%的APS 150µl，混匀后将胶液缓慢倒于玻璃板上，同时将另一块玻璃板平放在前一块上，利用虹吸作用使胶液进入两块玻璃板间，推动玻璃板至两块玻璃板对齐为止。在推动中时刻注意防止气泡进入。然后将96孔的鲨鱼齿梳子的无齿端插入梳子孔，用夹子将玻璃板均匀夹紧。室温下放置2小时左右以待凝胶聚合。
④电泳前的准备：将梳子拔出，用去离子水冲洗加样口，去除残余凝胶。同时擦洗玻璃板特别是检测口附近。在ABI377全自动测序仪上检查玻璃板（Plate Check），采用F模式。如基线不平，可继续擦洗玻璃板至基线平整。
（2）样品DNA的准备：
①上样缓冲液的配制：根据样品的数量配制上样缓冲液。成分如下：95%的甲酰胺：葡聚兰：GeneScanRox-500内标=5：1：0.11。
②混合：取扩增产物1µl与配好的上样缓冲液1µl混合，并于labfuge 400型离心机中2800转/分钟离心30秒以便样品混合均匀并且沉于底部。
（3）电泳分离与检测：
①预电泳：以1倍的TBE为电泳缓冲液，加于电泳槽中。1000伏恒压电泳15分钟，以便凝胶温度升至51℃利于样品在整个胶内均匀泳动。预电泳结束后，插入96道鲨鱼齿梳子并用电泳缓冲液仔细吹打加样孔以除去残余的尿素。
②样品变性：将与上样缓冲液混好的样品置于PE9600型扩增仪中95℃变性2分30秒，迅速置于冰水混合物中骤冷。
③加样：取样品1µl加入加样孔中，隔道加样以防样品间的互相干扰。在加样的过程中可以使GeneScan程序的预电泳任务处于暂停而不必退出，从而保持凝胶的温度。
④电泳：3000伏恒压电泳2小时30分，也可以在内标的350片段出来后停止电泳。分离距离36cm，激光强度为40Mw，凝胶温度保持在51℃，收集模式为F模式。
（4）分型：由与测序仪相连的电脑自动收集检测到的荧光信号，通过GeneScan3.1软件分析收集到的数据，确定各等位基因片段的大小。分析过程中，特别要注意校准内标，以防等位基因片段大小分析错误。由PE公司提供的GeneScanRox-500内标包括的在我们的电泳时间内能够检测到的片段主要有75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp，通过分型软件可以看出它们的排列很有特点，可以很容易地校准（如图1）。
图1 GeneScanRox-500内标片段电泳后的分布自左至右分别为75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp
（五）各等位基因核心序列及重复数目的确定—测序
我们采用测序的方法，确定各个Y-STR基因座的核心重复序列和不同等位基因的重复数目。
1、仪器与试剂 ABI377全自动DNA测序仪（PE公司） Biofuge台式离心机与Labfuge-400 台式离心机（Heraeus公司） PE9600型或9700型DNA扩增仪（PEKIN-ELMER公司） 金牌耐热DNA聚合酶（Taq Gold，PEKIN-ELMER公司） 稀释为2µmol/L的四对引物 尿素（上海生物工程公司产） 10倍TBE缓冲液（Ph8.0 含0.9M tris,0.9M boric acid,0.01M EDTA） 50%丙烯酰胺溶液（lang ranger gel solution，Acr：Bis=19：1，FMC公司） 10%的过硫酸铵（APS） 四甲基乙二胺（TEMED） 95%的甲酰胺溶液 葡聚兰 Wizard DNA纯化试剂盒（Promega公司产，内含DNA纯化树脂、直接纯化缓冲液、小型过滤柱） BIGDYE测序试剂盒（Applied Biosystem公司产，含测序反应缓冲液（其中有用四色荧光标记好的四种ddNTP及测序级酶）
2、步骤与方法：
（1）不同等位基因PCR扩增产物的获得 为了得到足够用于测序反应的不同等位基因PCR扩增产物，我们根据频率调查的结果选出具有不同等位基因型的个体进行50µl体系的扩增。
（2）扩增产物的纯化 为了除去扩增反应中多余的dNTP、引物、剩余的酶、缓冲液中的盐等杂质，得到较纯净的PCR扩增产物以利于测序反应，我们应用Promega公司产 的Wizard DNA纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。方法如下： ①取扩增产物50µl加入1.5ml离心管中，然后加入直接纯化缓冲液100µl、DNA纯化树脂1 ml，混匀静置10分钟。 ②将DNA纯化柱子接到注射器上，然后将离心管中的混合液倒入注射器中，慢慢推动注射芯将混合液打出。 ③去掉柱子，拔出注射芯然后加2 ml80%的异丙醇至注射器中。接上柱子，将异丙醇缓缓推出（洗柱）。 ④将柱子套在1.5ml离心管上，10000转/分钟离心2分钟，除去柱子中残余的异丙醇。 ⑤换一个新的1.5ml离心管套在柱子上，向柱子中加入40-50µl无菌去离子水，静置15分钟以待DNA溶解。 ⑥10000转/分钟离心20秒，收集离心溶液备用。
（3）测序反应 我们利用BIG DYE TERMINATOR测序试剂盒进行测序反应，所要测序的Y-STR基因座引物中不含荧光标记的那一条链作为测序反应引物。 ①反应体系：10µl体系 测序试剂盒中的反应缓冲液（master mixture) 4µl 引物2（不含荧光标记浓度为2µM） 1µl 纯化后的扩增产物 2µl 无菌去离子水 3µl ②循环参数：于PE9600或9700型扩增仪中循环扩增如下 96℃ 10秒 50℃ 5秒 60℃ 4分钟 以上变性、退火、延伸三步共循环25次，4℃保存
（4）测序反应产物的纯化 ①向扩增产物中加入66.7%的异丙醇90µl，混匀放置15分钟。 ②13000转/分钟离心20分钟，弃去上清。 ③加入66.7%的异丙醇250µl混匀，13000转/分钟离心20分钟，弃去上清。 ④于扩增仪上99℃加热11分钟，将样品烘干。 ⑤加入上样缓冲液（甲酰胺：葡聚兰=5：1）3µl溶解DNA备用。
（5）检测与分析： 采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合ABI377全自动DNA测序仪检测，电脑自动分型的方法分析各等位基因扩增产物的序列，确定其核心重复序列和重复数目。方法与步骤参见前述等位基因检测时的方法。测序采用的是6M尿素、6%的变性聚丙烯酰胺凝胶。测序结果分析采用的是 Sequencing Analysis 3.0和Sequence Editor软件进行分析。
（六）等位基因及单倍型多样性的计算与不同人群等位基因分布的比较
基因多态性（Gene Diversity， GD）和单倍型多态性（Haplotype Diversity，HD）采用公式1-∑Pi2计算，Pi为各等位基因或单倍型的频率。各基因座在不同人群的等位基因分布比较采用χ2检验。
三、结果与分析
（一）各Y-STR基因座群体遗传多态性
按照上述方法，对200个无关男性个体进行了等位基因多态性及分布频率调查，其中壮族、汉族各100例。
1、A10基因座共检出等位基因7个，片段大小分别为154、158、162、166、170、174、178bp，其中在壮族人群中检出片段大小为154 bp的等位基因，而未在汉族人群中发现（图2、图3、表2）。
表2 A10基因座等位基因在各人群中的出现频率和基因多态性：
2、A7.1基因座共检出等位基因6个，片段大小分别为161、165、169、173、177、181bp，片段大小为165 bp的等位基因仅在汉族人群中发现，在壮族人群中并未观测到，而片段大小为181 bp的等位基因仅在壮族人群中观测到（图4、图5、表3）。
图4 A7.1基因座等位基因电泳检测结果
图5 A7.1基因座等位基因分型结果
表3 A7.1基因座等位基因在各人群中的出现频率和基因多态性
3、A7.2基因座共检出等位基因6个，片段大小分别为170、174、178、182、186、190bp，其中片段大小为170 bp的等位基因仅在汉族人群中观测到（图6、图7、表4）。
表4 A7.2基因座等位基因在各人群中的出现频率和基因多态性
4、C4基因座共检出等位基因6个，片段大小分别为248、252、256、260、264、268bp，壮族汉族人群中均观测到了所有这6个等位基因（图8、图9、表5）。
表5 C4基因座等位基因在各人群中的出现频率和基因多态性
5、对各基因座等位基因在壮族与汉族人群中的分布
通过χ2检验比较，发现这四个基因座等位基因在壮族与汉族人群中的分布存在显著差异（P<0.05）。（表6）
表6 汉族和壮族人群四个Y-STR基因座等位基因分布比较
（二）复合扩增结果
我们进行了四个等位基因复合扩增的试验并获得了初步的成功，各基因座等位基因均可以得到较均衡的扩增，通过与频率调查时所采用的单个基因座扩增结果相比较，证明复合扩增的结果是准确的，为这几个Y-STR基因座在法医DNA检验在实践中的应用打下了良好的的基础（复合扩增的结果如图10）。
（三）各等位基因核心序列重复数目与命名
我们对A10、A7.1、C4、A7.2基因座的片段大小分别为154bp、169bp、256bp、178bp的等位基因进行了测序（图11、图12、图13、图14），得出其重复序列结构分别为（GATA）10、（GATA）10、（GATA）12（CATA）2（GATA）2（CATA）2（GATA）3。其中在C4基因座发现存在长度同为四个核苷酸但是序列不同的两个核心重复序列，但未发现不完整核心重复序列。
据此我们得出A10基因座各等位基因核心序列重复数目由小到大分别为10、11、12、13、14、15、16， A7.1基因座为7、8、9、10、11、12，C4基因座为19、20、21、22、23、24 ，A7.2基因座为8、9、10、11、12、13。根据1993年在意大利威尼斯赵卡的第十五届国际法医血液遗传学会（ISFH）DNA委员会推荐的方法，我们以核心序列重复数命名等位基因以便于各实验室数据的比较。
图11 A10基因座等位基因10测序结果
（四）不同民族各单倍型的分布频率与统计分析
我们共观察了汉族和壮族各100个个体，其中汉族人群共发现68种单倍型（50种为唯一的，另外18种发现了两例以上），壮族人群发现65种单倍型（44种是唯一的）。两个民族共有的单倍型共19种（列于表七后部）。
在这200个观察样本中共发现114种单倍型，其中76种单倍型在两个民族200个个体中只发现了一例，其余38种在这200份样本中发现了两例以上。经过计算，汉族人群和壮族人群中由这四个Y-STR基因座组成的单倍型的HD（Haplotype Diversity）值分别为0.9772、0.9786。结果如表7、表8：
表7 中国汉族人群四个Y-STR基因座单倍型及频率
表8 广西壮族人群四个Y-STR基因座单倍型及频率
（五）法医学应用相关指标的考察
1、组织同一性分析 取同一男性个体的头发、心脏、骨骼、肌肉、肾脏、脾脏、肝脏、脑组织等不同组织提取DNA进行四个Y-STR基因座的复合扩增，得到的分型结果完全一致。证明在同一个体的不同组织间，Y-STR基因座分型没有差异（图15）。
图15 同一男性个体不同组织的Y-STR基因座分型结果。自左至右分别为头发、心脏、骨骼、肌肉、肾脏、脾脏、肝脏、脑。
2、家系分析
由日常亲子鉴定案例中获得父子样品10例进行了两代家系分析，未发现突变（图16）。
3、男性特异性分析
我们在这四个Y-STR基因座各取10份女性DNA样品进行的复合扩增，未发现特异性扩增产物。
4、混合样品检验
我们进行了男女性混合DNA的检验实验，发现在混合比例达到1：50和1：100（男性：女性）时仍能够进行四个基因座的复合扩增，得到准确的男性DNA分型结果（图17）。
图17 男女性DNA混合样品分型结果，上为男女性DNA比为1：50，下为1：100
此外我们还进行了不同男性个体混合DNA的检测，结果可以清楚地表明样品是混合的（图18），一个个体每一基因座只应有一条带。
图18 男性混合样品电泳检测结果，自左至右分别为男性样品1、2号，1：1比例混合、1：10比例混合、1：20比例混合（1号：2号）。
5、灵敏度
分别取新鲜血液4µl、2µl、1µl用CHELEX法提取DNA（5% 的CHELEX溶液加入50µL），进行四个Y-STR基因座的复合扩增，均能得到清晰的结果（图19），灵敏度为1µl新鲜血液。
图19 灵敏度实验检测结果，自左至右分别为从4µl、2µl、1µl血液中提取DNA复合扩增的结果。
四、讨论
（一）四个Y-STR基因座在法医学应用方面的优势
1、四个Y-STR基因座的多态性及其与其他Y-STR基因座的比较
相对于定位于常染色体上的一些STR基因座来说，这几个Y-STR基因座的多态程度并不很高，但是与其他学者报道的数据进行比较，可以发现在Y-STR基因座中这四个Y-STR基因座等位基因较多、多态性较好，而且这四个基因座的等位基因片段较小，较容易扩增，所以相对于大多数已报道的Y-STR基因座更加适合法医DNA检验 （表9）。
而由这四个Y-STR基因座组成的单倍型也具有很高的多态性。根据我们的调查结果，在汉族人群和壮族人群中共发现114种单倍型，这四个基因座组成的单倍型多样性分别达到了0.9772、0.9786，虽然达不到同一认定的水平，但是也能够提供很有价值的个体多态信息了，特别是在排除方面，我们在200个个体中共检出114种单倍型，排除几率很高。
所以我们建立的这个四基因座复合扩增的检验系统为Y-STR基因座检验提供了一项有效的手段，当然如果将这四个基因座与其它Y-STR基因座结合，将会有更高的应用价值。
表9 部分Y-STR基因座片段大小及在不同人群中发现的等位基因数、基因多样性（Gene Diversity，GD）的比较
2、在混合检材检验方面的优势
由于Y-STR基因座的男性特异性，在混合样品的检验中，特别是无法用两步法分离的混合检材如混合血液，我们进行Y-STR基因座检验，可以很轻易地排除女性DNA的干扰，得到较为准确的DNA分型。在这方面的案件一般是强奸案或凶杀案中应用较多。
在一般的强奸案中，我们遇到较多的是精子与女性上皮细胞混合的情况即混合斑检验。遇到这种检材我们通常是采用两步法进行男女性DNA的分离后采用常染色体STR基因座检验，但是两步法经常遇到两种情况影响分型，
一是女性细胞去除不净在检验结果中男性基因型中混有女性基因型，另一种是由于男性精子含量少，在两步法分离时丢失男性DNA造成无法得到男性DNA分型，这两种情况都会对混合斑的检验造成很大的影响，条件差一些的甚至无法检验。
另外如果遇到做过男性输精管结扎手术的情况，靠两步法与常染色体STR检验就无法得到男性DNA分型。
在这些情况下，Y-STR基因座的优势就体现出来了，由于这四个基因座具有男性特异性，我们对于混合斑的检验可以不进行男女性细胞的分离，直接提取DNA进行检验，因此既可以防止女性DNA的干扰也可以避免在提取过程中男性DNA的丢失，大大地提高了检验的成功率。
根据国外专家的报道，部分Y-STR基因座（如DYS19、DYS390、DYS393、YCAⅡ）在男女性DNA之比为1：2000时都不影响Y-STR分型。
我们进行了这方面的研究，我们联合应用这四个Y-STR基因座检验时，在男女性DNA之比为1：100时仍能够对男性DNA进行正确分型，基本可以满足日常案件检验的要求。
同时应用Y-STR基因座检验还可以通过对精液中的男性上皮细胞的DNA分型解决男性无精子的混合斑的检验问题。
另外，由于我们这四个Y-STR基因座和大多数Y染色体特异基因座一样，一个人在一个基因座只应有一个等位基因，因此在确定混合样品中男性个体的个数就远远优于常染色体STR基因座检验。
例如，在常染色体STR检验中我们如果发现在一个基因座等位基因出现了两个或多个，我们一般情况下只能确定混合样品非一人所留时很难确定具体人数而且还要排除女性受害人的基因型干扰。
而对于我们这四个Y-STR基因座来说，一个基因座有几个等位基因就可以证明混合样品是由几个男性所提供，这一点对于轮奸案件的侦破（特别是受害人已死或犯罪分子隐瞒包庇同伙时）有着很大的帮助。
可见对于混合样品特别是男女混合样品的检验，尤其是当常染色体STR检验无法进行时，Y-STR基因座检验往往能起到很大作用。
3、一些特殊的单亲亲子鉴定方面的优势
在亲子鉴定方面，Y-STR基因座也有其独特的应用价值。在一般情况下，做三联体亲子鉴定可以采用常染色体STR检验，但是有些情况则不尽然。比如在只有父亲与儿子样本的情况下的单亲亲子鉴定，我们就可以通过比对父子间的多个Y-STR基因型得到更多的遗传信息。
此外，由于Y-STR基因座的父系遗传特点，在缺乏父亲样本的情况下，如果还能获得可疑父亲的同一父系亲属如其兄弟的样本，还可以用这些样本来代替父亲样本进行父子间Y-STR基因座的单亲亲子鉴定。
我们进行了一些家系分析，结果证明这四个Y-STR基因座符合父系遗传规律，可以应用于上述特定情况的单亲亲子鉴定中。
4、关于进行人类群体遗传研究及其在法医学检验中的价值
在人类群体遗传研究中，我们调查的这四个Y-STR基因座也有着很重要的贡献。由于Y-STR基因座定位于Y染色体的非重组区，在减数分裂时不发生重组，因此父亲的Y-STR遗传特征将会完全不变地遗传给儿子（当然发生突变的情况例外），因此Y-STR基因座对于研究人类父系进化史是一个很有利的工具。也正是由于这一特点，一般情况下Y-STR基因座有着较明显的地域性分布特征，不同地区的人群中不同的等位基因出现的频率存在显著差异。
当然如果地区间人群交流较多，人群间的差异就会减小。例如P.de.Kniff等人进行的调查研究中就发现在亚洲人群与欧洲人群中Y-STR基因座等位基因分布有着较大的差别，但同是欧洲白人如德国人和意大利人间的等位基因分布差异就不明显。他们推测这是由于人群的迁移和融合引起的。我们比较了这四个Y-STR基因座等位基因在汉族与壮族人群中的分布，发现存在显著差异。
有一些外国科学家提出通过研究Y-STR基因座群体遗传特征，有可能能够在鉴定时为我们提供有关嫌疑人的地域或种族特征的信息。正是由于Y-STR基因座相对于常染色体STR基因座来说等位基因分布的群体差异性更为显著，对于Y-STR基因座的等位基因分布频率调查就需要更为细致。
对不同人群中Y-STR基因座的等位基因分布频率进行详尽的调查，不仅可以为法医学鉴定提供必要的群体遗传数据，而且在推断嫌疑人的地域、种族特征方面也有着潜在的价值。
在我们的研究中主要进行了汉族和壮族人群中的四个Y-STR基因座等位基因及其单倍型分布频率调查，为这四个Y-STR基因座在实际检验中的应用提供了初步的统计数据。
此外，突变对于通过Y-STR基因座研究人类进化史和群体差异有着很重要的意义。如果突变率越高的话那么我们可以追溯的人类进化史就越短，但是高的突变率又可以形成更加丰富的Y-STR基因座单倍型，提供更高效的遗传标记。因而对于Y-STR基因座的突变率研究，各国的科学家都十分重视，并且纷纷展开研究。
其中Kniff和Kayser等人在他们联合多个国家的科学家进行的研究中提出了有关Y-STR基因座突变率的假设，在调查了13个Y-STR基因座后他们认为，对于一个Y-STR等位基因来说，有95%的可能性在1000代的遗传中并不发生任何改变。
当然他们的研究结果并不是普遍适用的，因为研究突变率需要针对不同的基因座进行大量的观察，这方面的工作是很艰巨的，需要进一步加强。
在我们的研究中也初步进行了一点工作，结合实际检验中亲子鉴定的案例对我们这四个Y-STR基因座进行了少量两代家系观察，未发现突变。
总之，我们研究的这四个Y-STR基因座单倍型具有较高的多态性，各基因座每个个体均为一个等位基因，符合父系遗传特征，且均为男性特异，灵敏度也较高，加之可以很好地进行复合扩增所以非常适合于法医DNA检验，有着较高的应用价值。
（二）关于扩增反应
1、单基因座的扩增
在单基因座扩增中,引物量可以根据不同基因座进行调整，以减少引物二聚体和杂带的产生,我们的经验是C4基因座的引物加入0.5µl（终浓度为0.1µmol/L），A7.1、A7.2加入1µl引物(终浓度0.2µmol/L)，A10加入1.5µl（终浓度0.3µmol/L)杂带较少，效果较好。
开始我们根据P.Scott White等人报道四个基因座的退火温度（分别为A10、C4 68℃，A7.1、A7.2 59℃）进行扩增未能成功，经过试验我们发现退火温度降到56℃时四个基因座均能扩增成功。这可能与我们和P.Scott White等使用的缓冲液、聚合酶不同有关。
关于扩增反应循环数，我们开始采用25个循环，得到的扩增产物很少，常常无法分型，改为35个循环后大大提高了扩增产物的产量，保证了得到准确的分型结果。
关于DNA聚合酶，我们曾经采用了多种酶进行扩增反应，结果发现只有PE公司的金牌耐热DNA聚合酶能使各基因座能够得到良好的扩增。其它酶效果较差，大多数情况下得不到扩增产物。
2、复合扩增
为了提高单次检测获得的信息量，有效地利用物证检材，便于检测和单倍型分型比对，建立一套适用于实际检验工作的试剂盒，我们还摸索了四个基因座复合扩增与检测的条件。在这四个基因座中C4基因座等位基因片段大小在240-270bp间，与其他三个基因座的等位基因并无重叠，因此单独标任意一种荧光标记均可与其他基因座分开，而其余三个基因座等位基因片段大小均在150-190bp间，其中A10与A7.2基因座等位基因片段大小有重叠分别为大小为170、174、178 bp的三个等位基因片段，为了将它们方便地区分开，我们将这两个基因座的引物分别标记不同的荧光，而A7.1基因座等位基因虽不和上述两个基因座的等位基因片段有重叠但是在大小为169、173、177、181 bp四个等位基因与A10及A7.2的几个等位基因片段大小只差1个bp，为了便于区分，我们需要将这个基因座的引物标记上与A10及A7.2基因座不同的荧光标记。在复合扩增中引物浓度的搭配及适当的退火温度是成功的关键。
根据我们的实践，四个基因座引物浓度分别为A10—0.4µmol/L、C4–0.1µmol/L、A7.1和A7.2均为0.2µmol/L，同时为了保证各基因座的引物能够顺利结合到模板上，我们将扩增反应退火温度降到了51℃，在这种条件下各基因座均能得到较为均衡的扩增，很少产生杂带。
（三）Y-STR检验应注意的问题
由于Y染色体的特殊性质,在实际法医学应用中这一系统存在着一些需要注意的问题。
首先，Y染色体上的非重组区的STR基因座呈连锁遗传，因此计算偶合概率时不能象常染色体那样通过几个STR基因座的偶合率的乘积进行计算。必须在实际观测中得出几个Y-STR基因座组成的单倍型在各人群中的分布，这样才能应用于法医DNA检验。其次在检验结果的判读上，如果检材和比对样品所检出的Y-STR单倍型不同，那么在一般情况下我们可以得出结论，认定检材与比对样品非同一人所留或检材与比对样品间无亲子关系。
这里我们唯一要考虑的问题就是在亲子关系检验中的突变问题。当我们遇到一些可疑情况时如检材和比对样品间的Y-STR单倍型只有一个基因座的一个重复单位的差别时，我们就要注意是否是突变造成的。为了确定这一点，我们可以进行更多的Y-STR基因座的检验，或者在可能时结合常染色体STR基因座检验。
另外，当我们检验结果为检材与比对样品的Y-STR单倍型一致时，我们所能够得出的结论通常只能是不排除，而不能进行认定。因为Y-STR基因座是父系遗传，同一父系下的所有男性个体的单倍型相同，进行同一认定或确定父子关系需一定的特殊环境，排除了其它可能的情况后才能进行认定。
此外不同的单倍型具有不同的价值，例如如果是该人群中的较为稀有的单倍型价值就高，而如果是最常见的单倍型价值就低。目前所进行研究的Y-STR基因座单倍型还远远达不到同一认定的水平，仍只能进行排除而不能进行认定。但是在实际案例中很多时候排除已经能够对案件起到很大的帮助了。
(四)实际案例中的应用
在成功地建立了四个基因座的复合扩增方法后，采用这一复合扩增系统对实际案件中的检材进行了检验，得到了较好的结果，证明这一系统完全可以用于法医DNA实际检验工作中。下面是两个较有代表性的案例。
案例1：
2001年4月，河南某县送检一份强奸案检材，为受害人阴道拭子。二步法消化后采用AmpFISTR Profiler Plus试剂盒扩增，得到的基因分型信息很杂，女性DNA较多，难以得到准确的男性基因分型信息。
我们采用四个Y-STR基因座复合扩增对一步消化的检材进行扩增，得到了清晰的分型结果（图20），不能排除嫌疑人李某。
图20 实际案例混合斑检验结果，左为嫌疑人血样，右为混合检材。
案例2：
2001年4月，山东某县公安局送检一起强奸致孕案，检材为男性引产胎儿肌肉组织及5名嫌疑人和受害人的的血样。
我们采用四基因座的Y-STR复合扩增系统进行检验，得到了清晰的结果，排除了四名嫌疑人，不能排除嫌疑人阎某（图21）。经常染色体STR检验（AmpFISTR Profiler Plus试剂盒），结果证实嫌疑人阎某为胎儿的生物学父亲。
图21、案例2 Y-STR基因座检验结果，左1为胎儿四个Y-STR基因座扩增产物检测结果，左2为嫌疑人阎某，向后为其它四个嫌疑人的检测结果。
因此，在父子关系鉴定中，Y-STR基因座较常染色体STR基因座更为直观地反应了父子间的关系，方法更为简便，具有较高的实用价值。
五、结论
本文通过对4个Y-STR基因座的研究分析，获得以下结论：
1、我们采用荧光标记引物、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合ABI377全自动测序仪检测，通过GeneScan3.1软件分析收集到的数据确定各等位基因片段的大小。据此我们首次获得了这4个Y-STR基因座等位基因及单倍型在汉族和壮族人群中的分布资料，为这4个Y-STR基因座应用于法医DNA检验和群体遗传学的研究提供了初步的资料。
2、首次建立了这4个Y-STR基因座的复合扩增体系，使之可以方便地适用于法医DNA检验。
3、通过实验观察，证明了这4个Y-STR基因座均符合父系遗传规律，均具有男性特异性及组织同一性的特点，表明它们适用于法医学检验工作特别是男性个体识别及特殊情况下的单亲亲子鉴定。
4、经频率调查与比较证明，这4个Y-STR基因座等位基因在汉族和壮族人群的分布有着显著差异。
5、我们应用这4个Y-STR基因座进行了一些实际的案件检验，并与常规方法得出的结论进行了比较，证明我们的检验结论完全正确，这4个Y-STR基因座完全可以应用于实际工作中。
6、通过测序确定各等位基因的核心序列重复数并根据国际名法对各等位基因进行了命名，为我们的数据能够有较好的重复性以便与各其他实验室的数据进行比较准备了条件。
7、存在的问题：首先，我们未能调查更多的家系数据，不足以说明这4个Y-STR基因座的突变率的情况。其次，限于经费和实验技能，未能对各基因座的各个等位基因都进行测序以了解更加详细的信息。这两方面的工作仍待以后补足。
结束语
Y染色体STR基因座应用于法医个人识别和亲子鉴定在解决常染色体STR检验技术难以解决的一些特殊情况如混合检材（特别是包括一个以上的男性成分时）的检验、某些特殊情况的单亲亲子鉴定时有着常染色体STR基因座所不可比拟的优势，因而成为了近年来法医遗传学研究的一个热点。
笔者不揣浅陋，选择了这一课题进行研究，调查了新近发现的四个Y-STR基因座在汉族和壮族人群中的分布数据，并且对其在法医DNA检验工作中的应用进行了初步的研究，希望能够对Y染色体STR基因座在我国的法医DNA检验工作中的应用有所帮助。
尽管笔者力求全面，但是由于本人学识及实验条件所限，有些问题未能进行深入研究，例如突变率及对各基因座各等位基因进行测序以进行更加深入的研究这两方面的工作就存在较大不足，以待今后解决，同时群体数据也还需要更大范围的调查。此外，论文中存在的一些偏颇、粗陋之处尚恳请各位专家、老师予以指正。
笔者进行实验和论文写作工作是在我的导师郑秀芬老师和叶健老师指导下完成的。特别是郑秀芬老师，在担负大量的科研和案件检验工作的同时对我进行了悉心指导，提供了大量的资料，使我能够顺利地完成我的工作。
此外公安部物证鉴定中心遗传室的胡兰、陈松、姜成涛、赵兴春、李万水、刘冰、李继周等老师以及我的同学靳大庆等都给了我很大的帮助，在此一并致谢。
程俊峰
2001年5月7日
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编辑 | 朱桐辉，南开大学法学院副教授、北京云证国际数据安全司法鉴定中心学术
