dr临床用于什么结核分枝杆菌特异性细胞表面的HLA-DR可用于鉴别活动性结核和潜伏性结核感染

由结核分枝杆菌（MTB）感染引起的结核病（TB）仍然是一种致命的传染病。据报道，2019年仍有1000万左右的感染病例及近140万的死亡病例。控制TB的一个主要障碍是难以区分活动性结核（ATB）和潜伏性结核感染（LTBI），识别ATB的延迟将会促进TB的传播，并阻碍全球TB战略的实施。因此，开发ATB和LTBI之间的鉴别工具将是全球抗击TB的优先事项。目前TB的防控策略主要侧重于ATB的识别和治疗，而少部分的LTBI患者在其一生中会发展为ATB。因此早期准确、快速实现对ATB和LTBI的鉴别对于控制TB非常重要。

在往期内容中，华中科技大学同济医学院附属同济医院（以下称为武汉同济医院）检验科的团队通过结合淋巴细胞的数量+表型+功能阐明了不同MTB感染状态下个体的淋巴细胞相关免疫特征，并建立了ATB和LTBI的鉴别模型。（点击回顾：【研究解读】首创“三位一体”免疫诊断模型，鉴别活动性结核病和潜伏性结核感染）

在2021年8月在线发表的文章中，同济检验团队继续研究了MTB特异性CD4+T细胞上包括HLA-DR、CD38、CD69和CD25在内的活化标志物的表达，进一步探索了可用于区分ATB和LTBI的潜在生物标志物。在本期内容中，我将为各位详解这一研究的相关结果。

受限于病原体检测以及各种分子检测方法灵敏度有限，干扰素γ释放试验无法区分ATB和LTBI；而基于基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学在内的多种新兴生物标志物虽表现出在MTB诊断方面的价值，然而很少有研究验证它们在不同群体、种族以及结核病流行地区的实际效益。此外，较高的操作成本和基础设施要求也阻碍了组学技术在临床中的应用和推广。因此，基于现有技术平台建立一种性能良好的方法来区分ATB和LTBI，就成为了临床目前的迫切需要。

既往研究表明，MTB特异性T细胞的激活可能与MTB抗原载量有关。MTB特异性T细胞在受到MTB抗原刺激时，会分泌包括IFN-γ、TNF-α和IL-2在内多种细胞因子。而相关生物标志物向临床应用的转化，需要得到进一步验证。对于结核病诊断而言，各种细胞活化和分化生物标志物的组合，也值得被充分探讨。为此，来自武汉同济医院的研究人员评估并验证了不同MTB特异性细胞上的各种活化和分化标志物对结核病诊断的潜在价值。

目前ATB和LTBI的鉴别诊断往往受限于现有检测方法的灵敏度、耗时长、高成本等问题，而基于流式细胞技术平台的各种活化和分化的生物标志物组合，在结核病诊断方面表现出潜在价值。

研究中入组对象均为T-SPOT检测阳性，结合临床和实验室评估，入组对象被划分为ATB患者以及LTBI患者两个队列。ATB的诊断标准为“分枝杆菌培养阳性和/或GeneXpert MTB/RIF结果阳性，且包含ATB相关支持性症状和放射学表现”；LTBI的诊断标准为“T-SPOT阳性但ATB证据缺乏”。本研究排除标准包括：（1）接受抗结核治疗超过2周，（2）年龄在17岁以下。

最终武汉同济医院队列共纳入90名受试者，包括40名ATB患者和50名LTBI患者；同济医院中法新城医院队列共纳入64例病例，包括29名ATB患者和35名LTBI患者。参与者的平均年龄约为60岁，一半以上是男性。ATB患者和LTBI患者在年龄和性别方面没有显著差异。患者基线特征如表1所示。

表1 纳入受试者的人口统计学和临床特征

在此研究中武汉同济医院提出了一个基于MTB特异性细胞的活化标志物评估模型，并在此后的中法新城医院的验证队列中进行了数据验证。

研究人员根据Th1细胞因子表达鉴定出MTB特异性细胞，并对这些细胞上活化标志物进行了检测。结果发现，ATB和LTBI患者在MTB特异性细胞上的HLA-DR和CD38表达水平上显著不同，但两组之间CD69和CD25表达水平无显著差异（图1）。

图1 武汉同济医院队列中MTB特异性CD4+T细胞上的活化标志物在区分ATB和LTBI患者中的表现。（A）点阵图显示了ATB和LTBI患者的MTB特异性细胞上HLA-DR的表达结果。（B）ROC分析显示HLA-DR在MTB特异性细胞上的表达在鉴别ATB和LTBI方面的表现。（C）点阵图显示CD38在ATB和LTBI患者MTB特异性细胞上的表达结果。（D）ROC分析显示CD38在MTB特异性细胞上的表达在鉴别ATB和LTBI方面的表现。（E）点阵图显示CD69在ATB和LTBI患者MTB特异性细胞上的表达结果。（F）点阵图显示CD25在ATB和LTBI患者MTB特异性细胞上的表达结果。（G）点阵图显示CD27在ATB和LTBI患者MTB特异性细胞上的表达结果。（H）ROC分析显示CD27在MTB特异性细胞上的表达对ATB和LTBI的鉴别效果。

尤为值得注意的是，如使用44%为阈值进行ATB和LTBI的区分，TNF-α+IL-2+细胞上的HLA-DR表达的AUC为0.901（95%CI，0.833-0.969），灵敏度为93.75%（95%CI，79.85-98.27%），特异性为72.97%（95%CI，57.02-84.60%）（表2）。虽然ATB患者MTB特异性细胞上的CD27表达明显低于LTBI患者，但是活化标志物联合CD27进行鉴别时并没有带来额外的益处。

表2 武汉同济医院队列中，MTB特异性细胞上HLA-DR区分ATB和LTBI的表现

ATB患者HLA-DR和CD38的表达明显更高，特别是在多因子表达的MTB特异性细胞上。多细胞因子表达的MTB特异性细胞上的HLA-DR比由单一细胞因子表达的MTB特异性细胞能更好的区分ATB和LTBI。

中法新城医院队列用来进一步验证在武汉同济医院研究队列中发现的生物标志物的性能。结果证实多因子MTB特异性细胞上的HLA-DR在鉴别ATB和LTBI方面的表现优良。使用44%为阈值时，TNF-α+IL-2+细胞上的HLA-DR灵敏度为90.91%（95%CI，72.19-97.47%），特异性为68.97%（95%CI，50.77-82.73%）。表 3总结了验证队列中MTB特异性细胞上HLA-DR的诊断性能。

表3 中法新城市医院队列中，MTB特异性细胞上HLA-DR区分ATB和LTBI的表现

中法新城市医院研究队列验证数据显示，以TNF-α+IL-2+细胞上的HLA-DR表达水平来鉴别ATB和LTBI，其灵敏性和特异性都较好，考虑该指标可以作为潜在有价值的生物标志物。

考虑到临床检测的技术可及性，本研究也分别针对目前较为热门的细胞因子以及细胞表面活化标志物的鉴别能力进行了探索。

首先研究人员测量了CD4+T细胞在MTB抗原刺激下分泌的Th1细胞因子（包括IFN-γ、TNF-α和IL-2）的表达，并通过表达谱的分析尝试探索区分ATB和LTBI的价值。结果显示，ATB和LTBI患者之间的一些共表达模式存在统计学差异（图2A）。而进一步使用ROC曲线分析评估细胞因子分泌模式对ATB的诊断能力时，发现所有候选分子产生的AUC低于0.7（图2B）。

图2 武汉同济医院队列中MTB抗原刺激下各种细胞因子表达模式在区分ATB与LTBI患者中的表现。（A）对齐的点图展示了ATB和LTBI患者中MTB抗原刺激下IFN-γ、TNF-α和IL-2的表达模式。（B）ROC分析显示各种细胞因子表达模式在区分ATB与LTBI患者中的表现。

MTB抗原刺激下，包括IFN-γ、TNF-α和IL-2在内的Th1细胞因子表达水平的检测组合模型不能很好地区分ATB和LTBI患者，AUC＜0.7。

接下来研究人员评估了CD4+T细胞活化标志物（包括HLA-DR、CD38、CD69和CD25）区分ATB与LTBI的能力。结果显示，ATB患者CD38和CD25的表达显著高于LTBI患者，而两组患者HLA-DR和CD69的表达无统计学差异（图3A）。但ROC曲线分析显示，CD25和CD38的AUC分别为0.699（95% CI, 0.589-0.809）和0.625（95% CI, 0.508-0.742）（图3B）。研究人员进一步研究相关指标与CD27联用的效果，其区分ATB与LTBI的能力并没有得到提高（图3C）。

图3 武汉同济医院队列中CD4+T细胞上各种标志物区分ATB与LTBI的效果。（A）散点图显示了ATB和LTBI患者中HLA-DR、CD38、CD69、CD25和CD27在CD4+T细胞上的表达结果。（B）ROC分析显示CD38和CD25在CD4+T细胞上的表达在区分ATB和LTBI患者中的效果。（C）散点图显示了ATB和LTBI患者中CD4+T细胞中HLA-DR-CD27-细胞、HLA-DR-CD27-细胞、CD38-CD27-细胞、CD38-CD27-细胞、CD25-CD27-细胞和CD25-CD27细胞的比例。

同济医院此前已开发了“三位一体”的流式检测方案以广泛服务于临床检测需求。此次研究主要针对ATB和LTBI的诊断鉴别需求，在现有流式技术平台上进行检验方法的开发和探索。

考虑到临床样本制备和检验的便捷性，同济医院先后从胞外细胞因子水平、CD4细胞表面活化抗原、根据胞内因子表达选出特异性细胞表面活化抗原三个层面进行了由浅入深的研究，并随后通过验证队列验证了此前的研究队列结果。

第一步: 针对目前比较受关注的、胞外的细胞因子水平进行检测，虽然两组患者出现了部分因子共表达差异，但结合ROC曲线分析其结果并不很理想；

第二步: 针对CD4细胞表面的常见活化抗原进行测定，同样未获得理想结果；

第三步: 进一步缩小目标细胞，根据Th1细胞因子表达鉴定出MTB特异性的细胞，并针对这类细胞表面的活化抗原进行测定，最终发现以44%为cutoff, TNF-α+IL-2+细胞上的HLA-DR表达具有潜在的鉴别价值；

第四步: 随后这一指标及其截断值在验证队列中得到了良好的验证。

我们可以在这个过程中看到同济医院层层递进的研究设计思路，它不仅非常经典，也可以在由浅入深的设计中看到同济医院研究成果临床应用转化的创新坚持。

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参考文献

Luo Y, Xue Y, Mao L, et al.  Activation Phenotype of Mycobacterium tuberculosis-Specific CD4 + T Cells Promoting the Discrimination Between Active Tuberculosis and Latent Tuberculosis Infection. Front Immunol, 2021,12:721013.