近年来，药用植物提取物因其伤口愈合特性而备受关注。本研究制备了掺有不同浓度石榴皮提取物 (PPE) 的聚己内酯 (PCL) 电纺纳米纤维膜。SEM 和 FTIR 实验结果表明，纳米纤维的形貌光滑、细腻、无珠状，PPE 很好地引入了纳米纤维膜中。此外，机械性能测试结果表明，由 PCL 制成并负载 PPE 的纳米纤维膜表现出显著的机械特性，表明它可以满足伤口敷料的基本机械要求。体外药物释放研究的结果表明，复合纳米纤维膜在 20 小时内立即释放 PPE，随后在较长时间内逐渐释放。同时，DPPH 自由基清除测试证实，负载 PPE 的纳米纤维膜表现出显著的抗氧化性能。抗菌实验表明 PPE 负载量较高，纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌表现出较高的抗菌活性。细胞实验结果表明，复合纳米纤维膜无毒，并促进 L929 细胞增殖。总之，负载 PPE 的电纺纳米纤维膜可用作伤口敷料。
一、引言
皮肤是人体最大的器官，调节新陈代谢并维持体内平衡。此外，皮肤在保护身体免受微生物入侵和有害环境因素的影响方面至关重要。如果皮肤的形态或功能出现任何损伤，必须及时使用敷料作为受影响伤口区域的屏障。然而，传统的伤口敷料，包括纱布、绷带等，无法满足当今患者的多样化需求。因此，配制一种能够有效满足患者多样化需求的伤口敷料至关重要。理想的敷料必须具有快速吸收伤口渗出液、保持伤口区域适当湿度、进行气体交换和隔离微生物的能力。此外，伤口敷料还应具有生物相容性、抗菌、抗炎和抗氧化特性。
近年来，静电纺丝制备的用于伤口敷料的纳米纤维膜引起了广泛关注。纳米纤维膜具有较高的表面积与体积比，可以模拟目标部位的细胞外基质 (ECM)，促进细胞粘附和增殖。极细的孔径可以将细菌与伤口区域隔离，而高孔隙率可以促进气体交换和多余渗出物的吸收。此外，使用电纺丝，可以根据患者的需求定制伤口敷料。电纺丝被认为是一种很有前途的伤口敷料制造技术。近年来，人们已经利用多种材料来制造电纺丝材料。一种这样的材料是聚己内酯 (PCL)，它是一种具有显著生物降解性、生物相容性、电纺丝性和机械强度的聚合物。FDA 已批准将 PCL 用于生物医学应用。因此，PCL 可能是制造电纺纳米纤维膜的极佳材料。
电纺纳米纤维膜中加入了许多生物活性剂或抗菌剂，以改善伤口愈合效果。自古以来，一些富含生物活性物质的植物提取物，包括黄酮类化合物、酚类化合物、多糖等，具有抗菌、抗炎和抗氧化作用，已被用于加速伤口愈合。石榴皮是一种原产于巴尔干半岛、伊朗和邻国的水果，广泛种植于新疆、河南、江苏和中国其他地区。石榴皮是多酚的极佳来源，具有潜在的抗菌、抗真菌、抗炎、抗氧化、抗寄生虫和抗癌特性。根据 Aminlari 及其同事的研究，PPE 可以通过增加 FN1 基因表达和细胞外基质成分（如 GAG 和胶原蛋白含量）来促进伤口愈合，因此可以被视为伤口愈合的治疗剂。迄今为止，尚未有关于电纺纳米纤维膜掺入 PPE 用于伤口敷料应用的研究报道。
本研究旨在利用静电纺丝技术生产 PCL/PPE 纳米纤维膜，因为它们具有出色的伤口愈合特性。将评估纳米纤维膜的形态、化学结构、亲水性、释放动力学和机械特性。此外，还分析了抗氧化活性、抗菌活性、生物相容性和体外伤口愈合效率。
二、材料和方法
2.1. 材料
石榴皮采集自新疆乌鲁木齐。福林酚试剂（BR 1 mol/L，批号：S25N11J131971）和没食子酸标准品（B20851 −20 mg，CAS#140-91-7，HPLC ≥98%）购自上海原野生物技术有限公司，聚己内酯（PCL）（Mw = 80,000）由上海凡泰生物技术有限公司提供，NN-二甲基甲酰胺（DMF）、碱性磷酸酶（PBS，PH7.4）、1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）等化学试剂均为分析纯。
2.1.1. 石榴皮提取物的制备
收集石榴皮，用去离子水清洗两次，以去除杂质。然后将石榴皮放在阴凉处干燥，用粉碎机研磨成粉末。将 100 g 粉末过 40 目筛后，在 60 °C 下浸泡在 600 mL 70% (v/v) 乙醇中 4 小时。溶液通过滤纸过滤，并在 60 °C 下使用旋转蒸发仪浓缩。收集石榴皮提取物 (PPE) 并在 4 °C 下储存以备后续使用。最后，采用 Folin-Ciocalteu 方法测定 PPE 中的多酚含量。
2.1.2. PCL 和 PCL/PPE 电纺纳米纤维的制备
首先，将 PCL 溶解在 DMF 中，得到 PCL 溶液（20%，w/v）。随后，将不同量的 PPE（5%、7.5%、10% w/w 的 PCL）溶解在 PCL 溶液中。电纺丝条件设定如下：针头与收集器之间的距离为 18 厘米，电压为 21 kV，流速为 0.5 mL/h。图 1 描述了制备过程。具有不同含量（5%、7.5%、10% w/w 的 PCL）的 PPE 纳米纤维膜分别命名为 PCL/5PPE、PCL/7.5PPE 和 PCL/10PPE。
图 1. 制备载有 PPE 的电纺纳米纤维膜。
2.1.3.扫描电子显微镜 (SEM) 分析
用 SEM 检查纳米纤维膜的形态。将电纺纳米纤维膜安装到铝箔上并涂上金钯。捕获从 SEM 获得的图像，并使用 Image plus 计算机软件计算纤维的平均直径。
2.1.4. 傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 分析
使用 FTIR 研究了聚合物分子与 PPE 官能团之间的相互作用。以 4 cm-1 分辨率记录 4500-500 cm-1 范围内的 FTIR 光谱。
2.1.5. 水接触角
使用水接触角测量 (DCAT21，Dataphysics Instrument GmbH，德国) 评估纳米纤维膜的亲水性。将纳米纤维膜切成正方形 (3 × 3 cm2)，并在其表面上分散 5 μL 去离子水滴。然后使用设备软件检查并记录不同纳米纤维膜的接触角。
2.1.6. 机械性能测定
使用纤维拉伸试验机检查纳米纤维膜的拉伸强度、断裂强度和杨氏模量等机械性能。将纳米纤维膜切成矩形片（3×0.5 cm2）并夹在机器钳口上。以 10 mm/min 的拉伸速率进行测试，并记录所得数据。
2.1.7. 体外药物释放能力
将纳米纤维膜切成矩形片（4×5 cm2），将每个样品 25 mg 浸入 6 mL 磷酸盐缓冲溶液（PBS，PH7.4）中。然后将样品放入振荡器中，在 37 °C 下以 100 rpm 的速度搅拌 60 小时。在每个时间点，取出 3 mL PBS 溶液，用等量的新鲜 PBS 替换。在 765 nm 的波长下检查 PBS 溶液，并使用校准图计算从纳米纤维中释放的 PPE 百分比。
2.1.8. 抗氧化活性
使用 DPPH 法测定复合纳米纤维膜的抗氧化性能。（27）制备 DPPH 乙醇溶液（0.2 mg/mL）并保存在黑暗中。纳米纤维膜样品的制备如下：称量 25 mg PCL、PCL/5PPE、PCL/7.5PPE 和 PCL/10PPE 纳米纤维膜，然后切成小块。将这些膜片浸泡在 3 mL 无水乙醇中。5 小时后，将 2 mL 上清液与 2 mL DPPH 溶液混合，并在黑暗中保存 30 分钟。用紫外分光光度计在517nm处检测溶液的OD值。根据以下公式（eq 1）计算抗氧化活性：
其中Ao为对照在517nm处的吸光度；Aj为空白在517nm处的吸光度；Ai为样品在517nm处的吸光度。
2.1.9.体外抗菌活性
采用纸片扩散法检测复合纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抗菌活性。首先，将纳米纤维膜切成小块（1×1cm2）。经过紫外灭菌后，将纳米纤维膜分别排列在涂有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的平板上。然后将这些板进行孵育（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的板在 37 °C 下孵育，而白色念珠菌的板在 28 °C 下孵育）。24 小时后，观察并记录抑菌圈直径。实验重复三次。
2.1.10. 细胞毒性试验
使用小鼠成纤维细胞 (L929) 中的 CCK8 试验测定纳米纤维膜的细胞毒性。首先，将纳米纤维膜的两侧在紫外线照射下灭菌 30 分钟。然后将膜浸入含有 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 1% 链霉素的 DMEM 培养基中 24 小时。将 L929 细胞接种在 96 孔板中 (1 × 104 细胞/孔) 并在 37 °C 下孵育 24 小时。然后用提取培养基替换 96 孔板中的培养基。将板进一步放入培养箱中 24 至 48 小时。随后，将 10 μL CCK8 引入每个孔中，并将板孵育 3 小时。孵育后，在 450 nm 处测量每个样品 (n = 3) 的吸光度值。细胞活力计算如下 (公式 2)：
其中 Asample 和 Acontrol 分别代表浸泡有或没有纳米纤维膜的培养基的吸光度值。
2.1.11. 体外细胞迁移试验
使用划痕试验获得复合纳米纤维膜的体外伤口愈合效果。将 L929 (1 × 105 细胞/孔) 细胞接种在孔板中并在 37 °C 下孵育 24 小时。使用 200 μL 微量移液器尖头创建划痕，并将无菌复合纳米纤维膜 (1 mg/孔) 添加到划痕中。然后将孔板在 37 °C 的培养箱中再放置 24 小时。在 0 和 24 小时时使用光学显微镜拍摄划痕以捕捉变化。使用 Image plus 计算机软件分析细胞迁移率，并按如下方式计算（公式 3）：
其中 Wd0 是 0 小时时划痕边界之间的距离，Wdt 是指定时间时划痕边界之间的距离。
2.2. 统计分析
所有数据均为三次重复的平均值，以平均值±SEM 表示。使用单因素方差分析确定统计学意义，并使用 Origin 2021 和 Graph Pad Prism 5 软件处理数据和图像。
三、 结果与讨论
3.1. PPE 中多酚含量的测定
PPE 由多种复杂多样的生物活性成分组成，其中多酚是主要成分。PPE 中存在的多酚具有抗菌和抗氧化特性。因此，我们采用 Folin-Ciocalteu 法评估 PPE 中的多酚含量。结果表明，PPE 中的多酚含量为 135.30 mg/g。Skrt等也采用乙醇溶剂萃取法提取石榴皮中的多酚，在优化提取条件后，多酚提取率为30.5mg/g，该值低于本研究中多酚提取量的平均值。这种差异可能是由于提取条件和所用溶剂不同，也可能是由于产地不同而导致的差异。
3.2 纳米纤维的形态和直径分布
利用SEM分析了含有不同浓度PPE的纳米纤维膜的形态。图2a-d分别对应于PCL、PCL/5PPE、PCL/7.5PPE和PCL/10PPE的SEM图像。纳米纤维表现出光滑、细腻、无珠状结构。PPE 的加入使纳米纤维的平均直径从 101.13 ± 31.62 增加到 278 ± 117 nm。这可以归因于 PPE 增加了纺丝溶液的粘度并降低了溶液的电导率。
图 2. 伤口敷料尺寸分布的 SEM 图像和直方图：(a) PCL、(b) PCL/5PPE、(c) PCL/7.5PPE 和 (d) PCL/10PPE。
3.3. FTIR 分析
在本研究中，FTIR 光谱用于验证 PCL 中 PPE 的封装。图 3 描绘了 PCL、PCL/5PPE、PCL/7.5PPE 和 PCL/10PPE 的吸收峰。对于 PCL，1733 cm–1 处的峰归因于 C═O 拉伸。对于 PCL，1733 和 1260 cm–1 处的峰归因于 C═O 和 C–O–C 伸缩振动，2954 和 2874 cm–1 处的吸收峰由 −CH2 的不对称伸缩振动引起，所有这些都是 PCL 的特征峰。与纯 PCL 相比，将 PPE 掺入 PCL 会导致峰强度略有降低。PPE 的主要峰之一位于 3352 cm–1，对应于 PPE 中多酚的 −OH 振动。随着 PPE 浓度的增加，该峰变得更宽。在复合纳米纤维膜中，由于多酚中的羟基和 PCL 中的羰基之间形成了氢键，PCL 的特征峰略有偏移。这导致羰基电子云密度的平均化。FTIR 光谱证实 PPE 已成功掺入纳米纤维中。
图 3.纳米纤维膜的 FTIR 光谱。
3.4. 水接触角
伤口敷料的亲水性有利于伤口渗出液的吸收，加速伤口愈合。在纳米纤维膜上，亲水表面可以刺激细胞在纳米纤维膜上的粘附、扩散和增殖。水接触角通常用于评估材料的亲水性。接触角为 0-90° 通常表示亲水性良好，而接触角为 90-180° 表示疏水性良好。在本研究中，进行了动态水接触角测量，以研究 PPE 对表面润湿性的影响（图 4）。纯 PCL 的接触角保持恒定在 134.4 ± 2.00°。然而，当纳米纤维膜的 PPE 含量增加时，10 s 时的水接触角从 49.47 ± 2.18° (PCL/5PPE) 降低到 21.93 ± 0.25° (PCL/10PPE)。PPE 含量与水接触角值呈负相关。这可能归因于 PPE 中存在大量亲水物质，例如多酚。
图 4. 纳米纤维膜在 1、5 和 10 s 时的水接触角。
3.5. 机械性能
理想的伤口敷料应具有与皮肤相当的强度和弹性。PCL、PCL/5PPE、PCL/7.5PPE、PCL/10PPE的断裂强度、断裂伸长率、杨氏模量如表1所示。纯PCL的断裂强度、断裂伸长率、杨氏模量分别为2.75±0.04 MPa、38.51±3.05%、7.13±0.10 MPa，而与纯PCL相比，加入PPE后拉伸强度和杨氏模量有所提高；PCL/10PPE纳米纤维膜的断裂强度、断裂伸长率、杨氏模量分别为11.47±1.20 MPa、65.85±6.75%、17.42±1.82 MPa。一个原因可能是 PPE 中多酚的酚羟基与 PCL 中的羰基氧原子反应形成氢键，从而增强了它们的机械性能。另一个原因可能是多酚含有芳香结构，可以提高膜的机械性能。
表 1. 纳米纤维膜的机械性能。
3.6. 体外药物释放能力
纳米纤维膜用作 PPE 输送的载体。而多酚作为 PPE 的主要成分，在抗菌和抗氧化活性中起着关键作用。因此，多酚的释放被描述为 PPE 的释放曲线。图 5 描述了释放过程，可分为两个阶段。在初始阶段，将纳米纤维膜浸泡在 PBS 中后 20 小时内观察到 PPE 的爆发释放。PCL/5PPE、PCL/7.5PPE 和 PCL/10PPE 的 PPE 释放率分别为 88.46 ± 3.75%、91.24 ± 2.10% 和 92.72 ± 0.61%（图 6）。多酚中的亲水基团和分散在纳米纤维中的大量提取物可能与爆发释放密切相关。然后，纳米纤维膜在 20 至 60 小时内持续释放。这可以归因于纳米纤维中 PPE 的持续释放。此外，PPE 的浓度会增加 PPE 的释放。
图 5. 60 小时内纳米纤维膜的累积释放曲线。
图 6. 纳米纤维膜的抗氧化活性。数据以平均值 ± SEM（n = 3）表示。P < 0.001 PCL/PPE vs PCL 的显著差异用三个星号 (***) 标记。
3.7. 抗氧化活性
伤口部位积聚的自由基会引起炎症并延迟伤口愈合。伤口敷料应具有一定的抗氧化性能，以抵抗过量自由基积累造成的损害。研究表明，PPE 中的多酚具有显著的抗氧化活性，能够消除自由基。为了评估纳米纤维膜的抗氧化活性，采用了 DPPH 测定法。结果如图 6 所示，表明纯 PCL 的清除能力明显低于其他组。具体而言，PCL 的清除率为 9.27 ± 0.28%。相比之下，加入 PPE 后，复合纳米纤维膜的清除率从 42.51 ± 3.21 提高到 64.67 ± 2.88%。PCL 和 PPE 负载纳米纤维膜的抗氧化活性差异具有统计学意义。PPE 的加入显著提高了膜的抗氧化活性。PPE 的抗氧化强度取决于其多酚分子中存在的酚羟基数量，从而产生更高的质子供体能力，从而稳定 DPPH 自由基。因此，纳米纤维膜中 PPE 含量越高，多酚含量和 DPPH 自由基清除率就越高。因此，将 PPE 添加到纳米纤维膜中有可能增强伤口敷料的抗氧化能力。
3.8. 抗菌活性
微生物污染是伤口愈合延迟的主要原因。因此，理想的伤口敷料应具有抗菌性能。然而，近年来，抗生素的使用有所增加，对患者有许多副作用，导致超级细菌的出现。PPE 是一种天然的植物皮提取物，副作用较小，可以防止微生物生长。在临床研究中，观察到导致伤口感染的最常见生物是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。进行了纸片扩散试验以评估纳米纤维膜的抗菌性能。图 7 和表 2 中显示的结果表明，纯 PCL 缺乏抗菌活性。然而，随着纳米纤维膜中 PPE 浓度的增加，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抗菌活性增强。此外，与纯 PCL 相比，PCL/PPE 纳米纤维膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌表现出更优异的抗菌活性。PCL/10PPE 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌区直径分别达到 19.15 ± 0.76、22.81 ± 0.29 和 20.01 ± 0.36 毫米。这一结论可以通过以下事实来解释：高多酚水平会阻碍微生物生物膜的形成，从而降低其生长和繁殖。PPE 纳米纤维对金黄色葡萄球菌的抗菌活性优于大肠杆菌。Wang 等人认为，这可能是由于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细胞膜结构不同。与金黄色葡萄球菌相比，大肠杆菌具有额外的磷脂外膜，可作为 PPE 的屏障。在本研究中，成功引入 PPE 使纳米纤维膜具有良好的抗菌性能。
图 7. PCL 和 PCL/PPE 纳米纤维膜的抗菌活性。(a) 大肠杆菌、(b) 金黄色葡萄球菌和 (c) 白色念珠菌。
表 2. 纳米纤维膜抑菌圈直径。
3.9. 细胞毒性分析
成纤维细胞是真皮的主要细胞，在组织重建中起着关键作用；因此，本测试中使用了 L929 细胞系。为了评估含有不同浓度 PPE 的纳米纤维膜的细胞毒性，进行了 CCK8 测定。图 8 所示的结果表明，细胞的活力不受纳米纤维膜渗滤液介质的影响。纳米纤维膜的细胞存活率在 24 小时时为 100.1 ± 2.00 至 119.7 ± 4.45%，48 小时后为 95.5 ± 2.00 至 101.5 ± 3.6%（对照组为 100%）。这些结果证实纳米纤维膜具有良好的生物相容性，PPE 可促进细胞增殖。
图 8. 在掺入不同浓度 PPE 的纳米纤维膜浸出液中培养的 L929 在 24 和 48 小时的细胞存活率。
3.10. 体外伤口愈合试验
细胞迁移在伤口愈合过程中诱导伤口收缩，这是触发后期愈合的重要步骤。本研究采用细胞划痕实验评估了PCL/PPE纳米纤维膜的细胞迁移效果，如图9和图10所示。结果表明，空白组和PCL组的细胞迁移率分别为45.39±1.46%和50.72±1.38%。然而，PCL/5PPE、PCL/7.5PPE和PCL/10PPE组的细胞迁移率明显较高，分别为70.68±0.94%、69.97±1.16%和84.92±0.73%。结果表明，含有PPE的电纺膜显著促进了L929细胞的迁移。因此，载PPE的电纺纳米纤维膜具有促进皮肤伤口愈合的潜力。
图 9. 对照组、PCL、PCL/5PPE、PCL/7.5PPE 和 PCL/10PPE 培养 0 和 24 小时后的 L929 细胞形态。
图 10. 纳米纤维膜体外细胞迁移率。数据以平均值 ± SEM（n = 40）表示。三个星号 (***) 表示显著差异，P < 0.001 PCL/PPE vs 对照组和 PCL。
四、结论
在本研究中，使用电纺丝方法成功制造了负载不同量 PPE 的 PCL，用于伤口敷料制备。研究了膜的形态、物理机械和生物学特性。根据 SEM 分析，纳米纤维的形态均匀且无珠粒。FTIR 分析证实 PPE 已成功掺入纳米纤维中。随着PPE含量的增加，膜的力学性能、亲水性和抗氧化性能得到改善。PPE的体外释放动力学表明，它在前20小时内以爆发式释放，随后的40小时内持续释放。PPE的存在增强了膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抗菌性能。此外，CCK8分析和划痕试验的结果表明，加入PPE可提高膜的生物相容性并促进L929细胞的增殖。基于这些研究结果，与PPE结合的复合纳米纤维膜可能是一种有前途的伤口敷料候选材料。
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