人类皮质器官组织是一种三维神经元培养物，正在成为研究大脑发育和功能障碍的有力工具。然而，有机体能否在功能上连接体内的感觉网络还有待证实。在这里，我们结合透明微电极阵列和双光子成像技术，对移植到成年小鼠后脾皮层的人类皮质类器官进行纵向、多模式监测。双光子成像显示了移植的类器官的血管化。视觉刺激会唤起类器官的电生理反应，与周围皮层的反应相匹配。多单位活动（MUA）和伽马功率的增加以及刺激诱发的 MUA 与慢振荡的锁相显示了类器官与宿主大脑之间的功能整合。免疫染色证实了人鼠突触的存在。将透明微电极植入类器官是一种多功能体内平台，可用于全面评估小鼠脑内人类神经元网络的发育、成熟和功能整合。
一、简介
干细胞技术的最新进展产生了人类皮质器官组织，这是一种由分化的人类诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的三维神经元网络，可再现大脑皮层的某些特征。这一生物工程进展有望成为下一代疾病模型、药物筛选和个性化医疗平台，以及可移植的神经假体，以恢复特定的缺失、退化或受损脑区。先前的研究表明，培养皿中的皮质器官组织具有与胎儿和出生后人类皮质发育相匹配的表达谱，而且器官组织能产生与新生儿脑电相似的电生理网络活动。与二维神经元培养物相比，皮质器官组织表现出复杂的神经元组织特征，如皮质层和更高的细胞类型多样性。与动物模型相比，皮质器官组织保留了人类患者的遗传背景。此外，最近有研究报告称，在体内植入小鼠皮质的器官组织可以建立移植体的功能性血管，为移植体提供营养和氧气，防止器官组织核心细胞坏死，并将轴突突起延伸到周围的宿主组织。
尽管这些前景广阔的研究为体内类器官研究奠定了基础，但它们主要集中在对来自少量细胞的神经活动进行局部和急性测量。移植到成年受体中的类器官对外界感官刺激产生的慢性功能反应还有待证实。这需要对移植器官组织的结构和电生理发展进行纵向研究。现有的记录技术目前限制了这种多模式实验的可行性。为了弥补这一技术空白，我们开发了一种基于光学透明石墨烯微电极技术的实验范式，用于纵向、多模态监测长期植入小鼠大脑后脾皮层的人类神经元网络的发育、成熟和功能整合。我们利用清醒的小鼠在后脾皮层内进行慢性植入，展示了大脑皮层有机体和周围组织对视觉刺激的电反应纵向记录，以及有机体血管化的光学成像。这些纵向多模态记录使我们能够研究神经活动在类器官/皮层边界的传播、对类器官产生的感觉刺激的功能反应以及周围皮层神经活动对移植类器官细胞尖峰活动的调节。我们进行了尸体组织学分析，研究了人的类器官与周围小鼠皮层的形态整合和突触连接。此外，我们还扩展了这一范例，研究了植入的类器官和宿主皮层对麻醉反应的差异。我们的工作提供了一种独特的多模式方法，用于研究类器官活动的演变及其在体内成熟过程中与周围皮层的功能整合。我们的工作将为未来研究功能整合的类器官移植铺平道路，这些研究将聚焦于类器官的广泛科学问题和潜在临床应用。
二、研究结果
2.1 类器官和微电极阵列共同植入可对类器官移植进行纵向监测
石墨烯微电极的光学透明性可将电记录与多光子成像和光遗传刺激无缝结合。我们使用透明石墨烯微电极阵列将异种移植皮质类器官和周围宿主皮质的电记录与光学成像结合起来。微电极阵列有十六个 100 微米的电极片，间距 500 微米，覆盖面积为 2 毫米×2 毫米（图 1a）。植入前，我们进行了电化学阻抗谱分析（图 1b、c）；1 kHz 时的平均阻抗约为 1.4 MΩ。为了进行植入，我们将微阵列的背面粘合到由两个 3 毫米盖玻片和一个 5 毫米盖玻片组成的玻璃塞上。图 1d 概述了皮质器官组织的生成和植入工作流程。hiPSCs 按照之前设计的方案4 分化并聚集成三维培养物。生成 7-9 周后，根据大小和形状选择单个皮质类器官进行植入。根据我们之前的工作9，我们将左侧脾后皮质（RSC）作为植入部位。RSC下有密集的血管网络9，这增加了异种器官移植的血管化可能性。我们使用成年（8 到 12 周大）的 NOD/SCID 小鼠作为受体。安装好钛头柱后，我们在目标区域移除一块约 3 × 3 毫米的头骨和硬脑膜。在避开大动脉和静脉的情况下，我们抽取了约 1 立方毫米的皮层，将单个皮层类器官放入空隙中，并将石墨烯微电极阵列/玻璃组件放在上面，以关闭暴露（图 1e）。动物在家养笼中时，阵列导线由定制的 3D 打印帽保护（图 1f，上图）（图 1g）；记录过程中取下帽子（图 1f，下图）。经过 1 周的恢复期后，每 2 周对 6 只小鼠进行一次电生理记录，共持续 8-11 周。大多数微电极阻抗在研究期间保持稳定（补充图 1）。图 2a 显示了一只具有代表性的动物在植入 69 天后的暴露情况；正方形标记的是石墨烯电极垫。红色勾勒出异种移植，与周围皮层相比，显示出轻微的衰退和变色。
图1 a 透明的 16 通道石墨烯微电极阵列，是植入 8 只动物体内的 8 个阵列的代表。b 具有代表性的石墨烯微电极阵列的电化学阻抗光谱；迹线代表同一阵列的各个通道。d 从皮肤成纤维细胞中生成人类诱导多能干细胞（hiPSCs）；培养 hiPSC 衍生的类器官培养物以植入小鼠皮层。e 有机体（Org）植入位置和微电极阵列（橙色）与后脾皮层（RSC）和视皮层（VIS）的位置关系。f 安装了保护帽的头柱效果图（上图），以及固定在支架上进行记录的头柱去掉保护帽后的效果图（下图）。g 头柱和保护帽在原笼中的小鼠。
图 2：类器官和大脑皮层的刺激诱发局部场电位记录a 类器官植入部位（红色轮廓）和周围皮层的显微照片。石墨烯微电极阵列的电极垫突出显示；红色通道被视为 “类器官通道”，而蓝色和黑色通道则覆盖宿主皮层。b 在对侧眼受到 100 毫秒脉冲、2 赫兹、4 秒钟的视觉刺激时（橙色条），记录局部场电位（LFP）的单次试验，同时使用白色 LED。c LFP 反映的试验平均值（20 次试验的平均值 ± sdv）。d 彩色图显示对第一个光脉冲的反应的峰值振幅（顶部）和峰值延迟（底部），如图 c 所示。e 反应的频谱图（32-150 Hz）（20 次试验的平均值）。插图：器官（通道 1）和视觉皮层（通道 2）重叠通道的放大频谱图（1-150 Hz）。b-e 面板中显示的记录是在 69 dpi 时进行的；显示的结果代表了总共五只动物的结果。
2.2 有机体对感官刺激产生神经反应
我们首先采用纵向多模态监测方法，通过施加视觉刺激并记录随后的电反应，研究有机体是否能对感官刺激产生功能反应。我们假设，当有机体与视觉皮层宿主组织整合后，它们将开始对视觉刺激产生功能活动。刺激引起的电反应是通过放置在动物右眼前的光纤耦合白光 LED 发出的光脉冲引起的。在整个实验过程中，我们观察到在类器官植入 3 周后至实验终止的记录中，类器官上方的电极通道确实出现了局部场电位（LFP）（n = 6 只动物，补充图 2）。图 2 显示了在小鼠皮层植入类器官 69 天后进行的一次实验的代表性结果。图 2a 显示的是植入部位的明视野图像。植入类器官上的六个电极通道用红色标出。在周围皮层上的通道中，最靠近视觉皮层的通道用蓝色标记。其余电极（黑色）覆盖在皮层与上矢状窦和横窦边界附近的组织上。图 2b-e 显示了以 2 Hz 频率发出 100 毫秒光脉冲持续 4 秒钟的记录结果（低通滤波，250 Hz）。在每个光脉冲开始时，LFP 遵循一致的双相形状。覆盖类器官的通道（红色）显示出视觉刺激响应，而在靠近视觉皮层的通道（蓝色）测得的响应最强。图 2c 显示了所有 16 个通道对光刺激的平均 LFP 反应。LFPs 在皮层/类器官边界表现出连续性，显示出从最靠近视觉皮层的区域开始向植入类器官扩展的传播模式（图 2d）。类器官的 LFP 反应与周围皮层的 LFP 反应一致，而且从皮层到类器官的 LFP 不间断传播表明记录时存在功能连接。如图 2 所示，类器官通道中的 LFPs 在较晚的记录时段（>50 dpi）最强，在植入后 3 周左右出现，当时进行了首次包含光刺激的记录（补充图 2）。
使用 Morlet 小波进行的频谱分析表明，在视觉刺激过程中，皮层和类器官通道在几个频率上的信号功率都有所增加（图 2e）。首先，我们观察到刺激频率及其二次谐波处的信号功率增加，这与之前在小鼠、猫和人的完整皮层中描述的功能活动一致。其次，视觉光刺激导致伽马（30-150 Hz）功率增加，这与之前在体内小鼠完整视觉皮层中的研究结果一致。具体来说，我们观察到 60-100 Hz 处的功率增加，这与单个刺激的开始时间相吻合。值得注意的是，与植入的类器官重叠的通道也出现了伽马响应，由于高频信号在脑组织中的传播减弱，伽马响应被认为是一种更局部的测量方法（图 2e）。高伽马频率范围（>100 Hz）的 LFP 被认为与局部尖峰活动密切相关。在对猕猴的研究中，发现 LFP 的高伽马功率与神经元的尖峰活动高度相关。我们的记录也显示器官和皮层通道都有高伽马范围的活动（图 2e），这表明这些活动来源于下层器官或皮层组织，而不是体积传导信号。总体而言，在覆盖类器官的通道（图 2e，通道 1）和靠近视觉皮层的皮层通道（图 2e，通道 2）中可以清楚地检测到视觉刺激的反应。移植后3周，器官样体显示出与周围皮层相等幅度的LFP反应，这表明异种移植神经元与周围皮层组织建立了突触连接，并接受了来自小鼠大脑的功能性输入。
2.3 多单元活动在感觉刺激下受到调整
接下来，我们使用透明石墨烯微电极进行记录，研究类器官细胞的尖峰活动是否受周围皮层神经活动的调节。我们评估了 0.5-3 kHz 带通滤波数据中的多单位活动（MUA）。与高频 LFPs 相似，高频 MUA 信号被组织衰减得更厉害，因此主要反映的是局部神经元发射（记录电极 100-200 µm 范围内）。图 3 显示了 MUA 记录。我们选择了两个具有代表性的通道（红色，通道 O1 和 O4）覆盖类器官异种移植，两个通道（蓝色，通道 C2 和 C7）覆盖周围皮层（图 3a）。在所有通道中，我们都观察到了自发的 MUA 事件，这些事件被定义为 MUA 跨过其标准偏差 -3 至 -4 倍的预定阈值的时间点（图 3b）。自发 MUA 事件在 8 到 11 周的实验中保持相对稳定，其尖峰率约为 2 Hz，与体外测量的类似老化有机体的活动一致。为了验证 MUA 记录的空间定位和每个通道的独特性，我们评估了事件触发的 MUA 曲线。事件触发 MUA 平均值的计算方法是：提取目标通道的 MUA 事件时间，并计算所有 16 个通道从目标通道事件发生前 1 毫秒到发生后 2 毫秒的平均 MUA 波形。如果相同的神经事件被多个通道捕获，那么附近的几个通道就会出现类似的 MUA 平均值。而如果这些通道记录的是独立的神经活动，那么 MUA 事件偏转只会出现在目标通道中，所有其他通道的平均值都将为零。我们的研究结果表明，覆盖在类器官或皮层上的每个通道记录到的 MUA 事件都是局部的，并没有在其他通道上出现任何扩散。在对 1 毫秒分档后的通道间重叠事件数量进行统计后，我们发现几乎不存在共同发生的事件。类器官和皮层通道之间的 MUA 事件重叠数在统计学上并不显著，属于偶然范围，这证明 MUA 记录源自局部神经发射，因此覆盖类器官的电极记录是类器官神经元在局部产生的，而不可能来自周围的皮层通道。
图 3：类器官和皮层的多单位活动。a 植入部位（红色轮廓）和周围皮层的显微照片。突出显示的是石墨烯微电极阵列的电极垫；通道 O1-O6 被定义为 “类器官通道”，而通道 C1-C7 被定义为 “皮质通道”。c 四个通道（O1、O4、C2 和 C7，以不同颜色显示）的事件平均 MUA 曲线的代表性示例（数据以平均值 ± sdv 表示），显示自发 MUA 事件的空间定位。d 分为 1 毫秒的时程后，对各通道重叠事件的计数显示几乎没有重叠事件。e 以 2 赫兹频率向对侧眼睛发出 4 秒一列的 100 毫秒光脉冲（黄色区域）的第一个脉冲时，整流 MUA 活动的试验平均值（6 次试验，数据以均值 ± sdv 表示）。f 通道 O4（类器官通道，上图）和通道 C7（皮层通道，下图）的平均锁相值（PLV）与频率的关系。箭头指向刺激期间（黑色）与无刺激期间（灰色）相比锁相值更高的频率区域。黑点表示 PLV 存在显著差异（95% 引导置信区间）的频率。g 通道 2 和通道 4 MUA 事件期间 5Hz LFP 信号相位的径向直方图。h 相位锁定空间范围的彩色图；两个通道的刺激诱导的 MUA 事件显示出最接近视觉皮层的 theta 振荡的最强相位锁定（右下角）。星号表示使用瑞利循环数据非均匀性检验（单侧），有刺激和无刺激（仅显示在左图）的事件之间的 p < 0.05。d、f、g 和 h 的源数据以及 f 和 h 的精确 p 值作为源数据文件提供。所显示的结果代表总共三只动物的结果。
2.4 与宿主皮层相比，移植的类器官对麻醉的反应不同
在清醒记录中看到移植类器官对感觉刺激的功能反应和对尖峰活动的调节后，我们接下来要问的是麻醉如何影响类器官与周围宿主皮层的自发神经活动。就像成人神经元整合到海马和嗅球已有的神经元网络一样，我们假设类器官异种移植最初接受的主要是局部输入，而丘脑核和神经调节中枢等远距离投射基本不存在。由于麻醉已被证明会影响大脑皮层的长程投射活动，我们假设异种器官移植在麻醉状态下会表现出与宿主大脑皮层不同的活动类型。在此，我们分析了 1.5% 异氟醚麻醉诱导的以高 LFP 活动期（突发）和相对沉默期（抑制）交替出现为特征的突发抑制模式。在图 4 所示的植入 3 周后进行的代表性记录中，有 6 个通道被标记为覆盖类器官，8 个通道覆盖皮层。异氟烷麻醉导致类器官与周围皮层神经元活动的减少幅度更大，其中与长程神经调控相关的伽玛频段减少幅度更大。与清醒状态相比，麻醉状态下的归一化功率比显示出更大的反差，尤其是更高频率的反差更为突出（图 4b）。与大脑皮层活动相比，类器官活动较弱的原因可能是缺乏胆碱能神经传导，而胆碱能神经传导与伽马活动有关。在清醒状态下，类器官的活动一般低于周围的皮层，对特定频段没有选择性（图 4e，f）。因此，类器官对麻醉和周围皮层的反应是不同的。我们的结果表明，类器官细胞的行为与成神经元类似，它们与局部神经元神经支配，但缺乏长程投射。
图 4：动物清醒并用 1.5% 异氟醚麻醉时皮层和类器官自发 LFPs 分析。b 小鼠麻醉（左）和清醒（右）时的平均频带功率。频率功率归一化为皮层功率（设为 1），类器官功率显示为皮层功率的一部分（*p < 0.05，双样本 t 检验）。数据显示为平均值 ± sdv（误差条），以及来自一只动物 16 个通道的单个数据点。Δ “代表 delta，”θ “代表 theta，”α “代表 alpha，”β “代表 beta，”Lγ “代表低伽马，”Hγ “代表高伽马。c 两秒的 LFP（低通滤波，250 Hz）历时显示了麻醉记录中的活动爆发。所示结果为五只动物的代表性结果。
2.5 类器官移植物被宿主血管化并与周围皮层整合
为了研究皮质类器官与周围宿主组织的形态整合，包括宿主血管的形成，我们使用了活体双光子成像和死后免疫染色。在每次记录过程中，由于微电极的透明性，我们使用明视野立体显微镜不受阻碍地检查植入部位的宏观结构（如图 2a）。植入九到十周后，小鼠在注射血管内示踪剂 Alexa Fluor 680 右旋糖酐49 后接受双光子显微镜检查。所有六只小鼠的类器官移植区域都含有小鼠血管。图 5a 显示了双光子成像的代表性结果。在获得整个曝光的低倍图（图 5a，左）后，我们获得了植入区域（图 5a，中）和周围皮层（图 5a，右）的高分辨率 Z 叠加图。类器官的血管清晰可见，证实了与宿主皮质组织的整合。与我们之前的研究结果一样，类器官区域的血管密度低于周围的皮层。
图 5：类器官血管化的活体成像和死后免疫组化分析。a 在注射血管内示踪剂 Alexa 680-Dextran 后，使用双光子显微镜（1240 纳米激发波长，512 × 512 像素，3 微米步长）获取的图像堆栈的深度投影（0-650 微米）。总图（左）中类器官植入区域以红色勾勒，类器官移植部位（中）和小鼠皮层（右）的血管显示出来。b 用 NM-95 抗体对 5 微米冠状切片进行免疫染色，检测人类核小体。植入区域（中心）主要包含人体细胞。c 用 CD31 抗体对 5 微米冠状切片进行免疫染色，检测内皮细胞。染色表明植入的类器官有血管形成（中间，箭头），但密度低于周围的皮层（右边，箭头）。d 用 NeuN 抗体检测神经元核的免疫染色表明植入区域的细胞是神经元。请注意，与小鼠神经细胞核（右侧，箭头）相比，NeuN 抗体对人类神经细胞核（中间，箭头）的染色较弱。b-d 面板中显示的切片用苏木精（蓝色）进行反染；一抗用辣根过氧化物酶偶联二抗和二氨基联苯胺作为显色底物（棕色）进行检测。e 使用类器官内的 NeuN、NM-95、Ki67 和 Olig2 对类器官进行成分分析，并与对侧皮质组织进行比较。数据以平均值 ± sdv（误差条）与单个数据点并列显示，每个条形图分析 n = 2 只小鼠的六个切片区域。源数据作为源数据文件提供。显示的结果是重复的，并且对总共 5 只（b）、3 只（a）或 2 只（c、d）动物具有代表性。
植入八到十一周后，动物被处死，用检测人类细胞（NM-95 抗体特异性检测人类核小体）、内皮细胞（CD31）和神经细胞核（NeuN）的抗体对大脑进行组织学分析。我们在所有动物中都发现了 NM-95 阳性（即人类）细胞，并注意到不同动物的异种移植大小存在一些差异。图 5b 显示了一只动物 NM-95 染色后的代表性冠状切片。类器官移植区域的 NM-95 染色非常明显，证实在整个实验过程中，人体细胞一直存活在小鼠皮质中。部分 NM-95 阳性细胞移除了植入部位（6 只小鼠，图 5b 右）。检测到的人体细胞远离植入部位 4 毫米，沿着胼胝体迁移（补充图 10）。在染色为内皮细胞的相邻切片中（图 5c），我们观察到血管穿过异种移植物，这与我们的活体双光子显微镜结果一致，显示了异种移植物的血管化。NeuN 与苏木精联合染色显示，在最后记录时，类器官移植中约 48% 的细胞具有神经元表型（图 5d，e）。在类器官区域检测到的 PSD-95 进一步证实了类器官细胞的神经元表型，PSD-95 是兴奋性神经元突触后密度标记（图 6）。对 NM-95、增殖细胞（Ki67）和少突胶质细胞（Olig2）的额外染色结果显示，类器官细胞由约 82% 的人类细胞、约 5% 的增殖细胞和约 7% 的少突胶质细胞组成（n = 3，图 5e）。
图 6：免疫荧光染色共聚焦显微镜下，在小鼠器官移植后 11 周进行最后一次电生理记录后，对小鼠器官样植入区域的人类核小体（NM-95）、人类细胞质（STEM121）、突触素（Syn；突触前末端囊泡蛋白）和突触后密度（PSD-95）进行免疫荧光染色。a 沿着类器官植入体（Org）和视觉皮层（Visual，箭头所指）的边界（粉红色划线），Syn（红色）和 PSD-95（绿色）与人类细胞共定位。b 在类器官植入体和后脾皮层（RSC）边界（粉红色划线）区域观察到被 Syn、PSD-95 和小鼠细胞（箭头）包围的人类细胞。c 观察到被 PSD-95 和 Syn 包围的人类细胞（箭头）沿着胼胝体（CC）移动。CC 和视觉皮层之间的边界用粉红色划出。注意 Syn 和 PSD-95 的密度较小，这是胼胝体的特征，因为髓鞘轴突投射较长，突触末端较少。d Syn 阳性（绿色）和 hSyn 阴性（红色）的突起被定义为小鼠突触前末端。小鼠突触前突触点的数量在类器官植入体边界较多（d，空心箭头），但在植入体中心仍然存在（e，空心箭头）。f 人突触前终端的密度向类器官中心显著增加（上条形图，p = 0.0176），而小鼠突触前终端（即 +Syn/-hSyn 点）的密度向类器官中心显著降低（下条形图，p = 0.008）（*p < 0.05，双样本 t 检验）。数据以平均值 ± sdv（误差条）与单个数据点并列显示，对一只小鼠的 26 个脑区的 11,979 个 hSyn+ 和 Syn+ 点进行了分析。源数据作为源数据文件提供。所显示的结果是两只动物的代表性结果。
最后，为了研究类器官和皮层之间的突触连接，我们对人类核小体（NM-95）、突触前囊泡蛋白突触素（Syn）和突触后密度（PSD95）进行了免疫荧光染色。在图 6a-c 中，我们沿移植器官（Org）和视觉皮层（Visual）的边界（以粉红色划出）、器官和后脾皮层（RSC）的边界（以粉红色划出）以及胼胝体（CC）内，检测了 Syn（红色）和 PSD95（绿色）与人类细胞（白色）的共定位。我们观察到，在小鼠视觉皮层（图 6a，箭头所示）、后脾皮层（图 6b，箭头所示）和胼胝体（图 6c，箭头所示）的边界处，器官样细胞与突触前、后标记物明显共定位，这表明突触具有连通性。此外，我们还研究了类器官内的突触素是来源于小鼠还是人类，并通过尸检免疫荧光分析评估了异种移植类器官与宿主小鼠皮层之间的双向突触连接。据我们所知，目前还没有小鼠特异性突触素标记物，因此我们对人类细胞质（STEM121）、突触素和人类特异性突触素（hSyn）进行了三重染色（n = 2）。通过关注 Syn 和 hSyn 的重叠部分，我们可以确定哪些突触前点状突触源自人类。其余Syn阳性而hSyn阴性的突触前点状物则被视为小鼠突触前点状物。图 6d 和 e 分别显示了距视觉皮层边界 100 微米处和类器官中心的突触前点状突起和类器官内的神经元突起。我们在类器官边界（图 6d）和中心（图 6e）观察到小鼠突触前点状突起（空心箭头）集中在类器官突起附近，这表明小鼠神经元与类器官形成了突触前连接。通过量化人和小鼠突触前点状突触的密度，我们观察到小鼠点状突触在类器官边界的密度明显高于类器官中心，这可能是由于类器官靠近小鼠皮质；而人的点状突触在类器官中心的密度高于边界，这可能是由于人的细胞在形态上与小鼠皮质整合时分散所致（图 6f）。我们还在靠近类器官外缘的小鼠视皮层中观察到突触前点状细胞和 STEM121 染色。我们在类器官中观察到的小鼠突触前点状突触，以及在小鼠大脑皮层中观察到的人类突触前点状突触，证明在最后一次记录时，类器官和小鼠视觉皮层已经建立了双向突触连接。类器官中的小鼠突触前点状突触为类器官对视觉刺激产生功能反应所需的突触连接提供了证据，正如电生理记录中所观察到的那样。
三、讨论
多能干细胞技术的最新进展使得从外周组织（如皮肤活检组织）中分离出的hiPSCs能够生成神经元细胞系和皮质类器官。虽然这些器官组织与人脑早期发育阶段的某些特征相似，但培养的器官组织缺乏天然的大脑微环境，会影响重编程神经元的表型和成熟。此前，我们已经证明，将人类皮质器官移植到成年小鼠脑中会导致其进一步分化和血管化。在本研究中，我们进一步推进了这一范例，引入了光学透明石墨烯电极微阵列，可对移植体和周围宿主神经元回路中的神经元活动进行多模式纵向监测。这种设置使我们能够检查类器官与皮层的形态整合，并揭示类器官随着时间的推移与内源性感觉皮层的功能整合。如果使用传统的金属电极，我们就无法在不移除电极和破坏植入部位的情况下，获得清晰的视野来检查类器官移植物和与感觉皮层的接近程度。干细胞和神经记录技术的结合为研究人类神经元网络层面的功能障碍、发育性脑病以及类器官如何作为神经假体恢复不同脑区的功能提供了机会。
我们的研究结果表明，植入石墨烯微电极不会阻碍异种移植体的发育和血管化，而且可以通过光学成像（包括双光子显微镜）检查 LFP 和 MUA 神经元活动。利用这项技术，我们证明了器官组织对感觉刺激的功能反应存在若干差异。MUA事件与更靠近视觉皮层的通道的LFP锁定，进一步证明了人类神经元由于与小鼠皮层形成了突触连接而参与了对视觉刺激的网络反应。试验平均LFPs和自发MUA尖峰的振幅也随着时间的推移而增加，这表明类器官与微电极阵列的耦合得到了改善。在使用 1.5% 异氟醚麻醉的情况下，我们观察到相对于周围皮层，类器官活动的伽玛功率选择性下降。伽马活动与胆碱能神经调节有关。假设异种移植物的胆碱能神经支配低于大脑皮层，那么通过麻醉抑制胆碱能活动将不成比例地降低类器官相对于宿主大脑皮层的伽马功率。事实上，有研究表明，成体神经元首先获得局部连接，随后获得长程连接。麻醉剂在作用机制和对皮层活动的影响方面存在很大差异，研究其他麻醉剂对异种移植器官的影响将是这一方法在未来的有趣应用。
我们实验的成功取决于柔性透明石墨烯装置的工程设计。这种装置使我们能够在小鼠大脑皮层中保留长期植入的微电极阵列，进行电生理记录，并能随时对器官移植部位进行成像。为此，我们设计了一种带有保护外壳的轻型头柱组件，用于在记录过程中通过 ZIF 连接器将石墨烯阵列连接到数据采集系统。该组件将阵列与玻璃窗插入件融合在一起，为长期植入的小鼠提供了机械稳定性和耐用性。本研究旨在经过 11 周的体内记录和成像后，对异种移植进行组织学验证；未来还将进行更长时间的实验。这项技术的另一个未来发展方向是利用电极的透明性，结合钙成像技术观察类器官神经元的尖峰活动，或通过狂犬病毒逆行追踪类器官和小鼠皮层之间的轴突投射，正如其他研究人员在体内iPSCs 和体外球体 中所证明的那样。在本实验进行时，这些方法尚未针对我们的特定细胞系建立，但可在未来开发使用。
虽然在小鼠大脑中移植人类皮质器官组织仍处于起步阶段，但我们的研究向这一生物模型系统的全面功能评估迈出了一步。我们设想，在未来的道路上，这种干细胞和神经记录技术的结合将用于在生理条件下建立神经元回路层面的疾病模型，检查患者特定遗传背景下的候选治疗方法，以及评估有机体在整合后恢复特定丢失、退化或受损脑区的潜力。
四、研究方法
4.1 动物护理
本研究中描述的所有动物实验均按照美国国立卫生研究院的《实验动物的护理和使用指南》进行，并获得了加州大学圣地亚哥分校动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（协议 S14275）。免疫缺陷型非肥胖糖尿病（NOD）/严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠（6-8 周龄）购自杰克逊实验室（JAX Stock：001303）。本研究使用的是 8-12 周龄的雌性小鼠。小鼠被饲养在高压灭菌的笼子里，在标准条件下（20-22 °C，40-60%相对湿度），光照/黑暗周期为 12 小时，自由进食和饮水。
4.2 皮层类器官的生成
所有试验均按照机构审查委员会（IRB）和胚胎干细胞研究监督委员会（ESCRO）的指导原则和规定进行。用于生成皮质类器官的 hiPSCs（WT83）是从皮肤活检获得的成纤维细胞中重新编程而来4。在涂有 Matrigel 的培养皿上培养的 hiPSC 群体，每天用 mTeSR1喂养约 7 天后，用 1:1 的 Accutase:PBS 溶解。hiPSCs 被移入一个六孔板（约 4 × 106 个细胞/孔）中，并加入 10 µM SB431542（Stemgent，Cambridge）、1 μM Dorsomorphin（R&D System）和 5 µM Y-27632 的 mTeSR1，然后在摇床悬浮液中培养（95 rpm，37 °C）。用 mTeSR1（含 10 μM SB431542 和 1 μM Dorsomorphin）培养已形成的球体 3 天，然后用培养基 1 [Neurobasal 、1x Glutamax 、2% Gem21-NeuroPlex、1% N2-NeuroPlex (Gemini Bio-Products) 、1% 非必需氨基酸 、1% 青霉素/链霉素 (P/S.) 、10 μM SB431542 和 1 μM Dorsomorphin]培养；10 μM SB431542 和 1 μM Dorsomorphin]，连续 6 天，隔天一次；培养基 2（Neurobasal、1x Glutamax、2% Gem21、1% NEAA 和 1%P/S）与 20 ng/mL FGF-2（，连续 7 天，每天一次；培养基 2 添加 20 纳克/毫升 FGF-2 和 EGF（PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA），连续 6 天，隔天一次；培养基 2 添加 10 纳克/毫升 BDNF、GDNF 和 NT-3（均为 PeproTech）、200 μM L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，St. 美国密苏里州圣路易斯市）和 1 mM 二丁酰基-cAMP（Sigma-Aldrich），连续 6 天，隔天一次。皮质器官组织随后在 Media2 中保存，直至使用。两个月大的皮质类器官用于移植。
4.3 有机体和石墨烯微电极阵列的植入手术
头柱植入、开颅手术、类器官植入和石墨烯微电极阵列植入均在一次手术中完成。手术前十二至二十四小时，动物通过饮用水接收 0.53 毫克/毫升磺胺甲噁唑、0.11 毫克/毫升三甲氧苄啶和 40 毫克/毫升布洛芬。手术前四小时，动物注射一次 4.8 毫克/千克地塞米松（静脉注射）。麻醉时，动物接受 50 毫克/千克氯胺酮和 5 毫克/千克赛拉嗪的鸡尾酒麻醉，手术期间辅以 0.1-1% 氧气异氟醚。麻醉诱导后，动物接受单剂量 0.05 毫克/千克丁丙诺啡（静脉注射）和 500 毫克/千克头孢唑啉（静脉注射）。切除皮肤后，清洗骨骼，使用氰基丙烯酸酯胶水（VetBond）将皮肤与伤口边界的骨骼连接起来。然后，用 35% 磷酸凝胶（Kerr Dental）对颅骨进行 60 秒钟的蚀刻，再用无菌的 0.9% 氯化钠溶液洗净。然后，在骨头上涂一薄层粘接剂（OptiBond，Kerr Dental），并用紫外线固化。头柱用牙科粘合剂（Tetric Evoflow）固定。为进行电生理记录，在嗅球上植入一个参比电极（#000 微型螺钉），并用牙科粘合剂固定。然后，用牙科钻去除覆盖植入区域的一块直径为 3.5 毫米的圆形骨片。取出硬脑膜后，用抽吸法取出覆盖上丘的一大块直径约 1 毫米的后脾皮质（相对于 Bregma -3.5 毫米，相对于中线 +0.75 毫米）。在止住抽吸部位的出血后，将一个类器官置于空隙内。将具有 16 个通道的石墨烯微电极阵列粘合到由两块 3 毫米和一块 5 毫米盖玻片组成的玻璃塞上，并将其置于开颅手术的顶部，然后用牙科粘合剂（Tetric Evoflow）密封。
4.4 石墨烯微电极阵列的电化学表征
使用 Gamry Reference 600 恒电位仪在 0.01 M 磷酸盐缓冲盐水（溶于去离子水的 Sigma-Aldrich P3813 干粉）中进行电化学阻抗谱分析（EIS）。采用三电极配置，Ag/AgCl 为参比电极，铂为对电极。在开路电位下测量了 100 kHz 至 1 Hz 的 EIS。整个电极配置系统被放置在一个自制的法拉第笼中，以消除噪音。
4.5 电生理数据记录
用 5%异氟醚对动物进行麻醉（诱导），并保持在 1.5% 的浓度下进行维持。在麻醉状态下，固定动物头部，取下保护帽，将阵列连接到记录装置上。在麻醉状态下记录 5-10 分钟后，去除麻醉，让动物恢复。约 10 分钟后，继续记录。10 分钟后，继续记录。
电生理记录使用 RHD2000 放大器板和 RHD2000 评估系统（Intan Technologies）进行。采样率设置为 20 kHz，并使用记录系统内置的 0.1 Hz 以上滤波器去除直流偏移。Intan 数据被导入 MATLAB（MathWorks），并使用自定义脚本进行分析。
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4.6 视觉光刺激
将白光 LED 连接到光纤电缆上，以提供光刺激。光源距离动物和电生理记录设备约 1 米，以避免串扰和电噪声。光导纤维的顶端距离动物的对侧眼睛约 3 毫米，以照亮整个眼睛。以 1、2、5、10、15、55 和 85 Hz 的频率发出 5 至 100 毫秒的光脉冲（即光刺激），间隔时间为 1 至 5 秒，每次实验重复 10 至 20 次。刺激是通过定制的 MATLAB 代码驱动的 DAQ 系统来控制的。为了使刺激和记录同步，从 DAQ 系统向 Intan 记录系统发送刺激锁定触发信号。
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