随着与生物系统接口的生物电子学需求的不断增长，推动了材料的发展，以解决电子设备和生物组织之间的不匹配问题。到目前为止，各种不同的聚合物已被用作生物电子学的基材。特别是，生物聚合物已被研究作为生物电子学的下一代材料，因为它们具有高生物相容性、生物降解性和可持续性等有趣的特性。然而，由于传统制造方法与此类生物聚合物的兼容性有限，它们的应用范围受到限制。在这里，我们介绍了一种与导电材料集成的壳聚糖纳米纤维 (CSNF) 薄膜和大面积薄膜的制造工艺。为此，我们通过使用激光烧蚀制造的聚酰亚胺掩模的简便过滤工艺对碳纳米管 (CNT)、银纳米线和聚 (3,4-乙烯二氧噻吩)：聚 (苯乙烯磺酸盐) (PEDOT:PSS) 进行图案化。该方法在纳米纤维纸上生成导电材料馈线，并展示了与共轭和高纵横比材料的兼容性。此外，我们利用这种制造工艺制造了 CNT 神经接口电极，并展示了对活蝗虫快速伸肌神经的外周神经刺激。该方法可能为未来基于生物聚合物纳米纤维的生物电子设备铺平道路。
一、简介
用于生理记录、生化评估和电调制的生物电子学是快速发展的数字医疗领域的一项新兴技术。具有高生物相容性、灵活性和可降解性的生物电子设备已被广泛用作可穿戴或可植入的人体健康监测系统、软机器人或人机界面。这些设备用于接触柔软的三维 (3D) 和移动组织。机械柔顺性基板和钝化层可实现与组织表面的保形接触和更好的粘附，从而促进直接生理记录。特别是，合成或天然衍生的聚合物已取代传统的刚性和机械强度高的无机材料作为基板的组成部分。它们为电极提供可拉伸性和顺应性，以跟随生物组织的弯曲和伸长。具体而言，生物衍生的生物聚合物因其高生物相容性、可生物降解性、可持续性和天然丰富性等显著特点而受到越来越多的关注。
最重要的是，某些类型的生物聚合物最近吸引了大量研究，用于生物电子学。例如，多糖（如海藻酸盐或几丁质/壳聚糖）以及蛋白质（如丝素蛋白）不仅显示出作为生物聚合物的上述独特特性，而且具有低免疫原性和炎症反应。然而，用于溶解或分散此类生物聚合物的溶剂数量有限，这导致在生产厚度均匀的薄膜基材和赋予制造生物电子设备所需的电导率方面存在技术困难。虽然传统上采用电纺丝或电喷雾方法来生产薄膜或微/纳米纤维基材，但只有少数类型的溶剂可用于溶解或分散这些生物聚合物纳米纤维 。此外，基于标准光刻或精确印刷技术将精确微图案化的电极与此类材料集成也存在挑战。通常，此类方法需要昂贵的设备、使用蚀刻剂的严苛化学或物理工艺，以及与生物聚合物不兼容的严格控制的油墨制备。因此，为了使生物聚合物成为生物相容性导体的有前途的构建块，有必要发现新的制造工艺，并选择不会被这些工艺溶解或分解的生物聚合物。
这里我们报告了一种简单而通用的制造工艺，无需使用光刻或印刷技术即可生产基于生物聚合物的电极。制造工艺仅包括制备硬掩模和真空过滤。使用快速激光微加工工艺，使用聚酰亚胺 (PI) 薄膜创建具有所需微图案的掩模。由于真空过滤工艺与大分子兼容，我们选择壳聚糖纳米纤维 (CSNF) 作为基材和钝化层。CSNF 来源于大量存在的甲壳类动物的外骨骼，由于其优异的物理性能及其作为生物聚合物的特性，在纸电子和医疗保健领域引起了广泛关注。由于高纵横比，只需通过真空过滤工艺即可形成具有良好控制厚度的纳米纤维基材。此外，我们表明该工艺也适用于使用高纵横比导电材料在 CSNF 纸上制造微图案。我们利用导电大分子（如碳纳米管 (CNT)、金属纳米线 (NW)和聚（3,4-乙烯二氧噻吩）：聚（苯乙烯磺酸盐） (PEDOT:PSS)作为电极，利用其尺寸大且与过滤过程兼容的优势。作为原理验证，我们展示了使用 CSNF/CNT 纸基电极对蝗虫胸神经的刺激。
二、结果与讨论
2.1 刺激电极的制造
图 1a 展示了用于刺激的 CSNF 纸基电极的简化制造过程。首先，通过使用水射流系统对壳聚糖粉末进行机械纤维化来生产 CSNF。我们将 CSNF 分散在水中至 0.1 wt%。通过聚偏氟乙烯(PVDF)亲水滤膜过滤 CSNF 分散体，可生产出具有高均匀性和光学透明度的壳聚糖纸。通过调节 CSNF 分散体的体积，可以很好地控制纸张的厚度。与用于生产用于细胞支架或药物输送的 CSNF 的电纺丝工艺相比，通过水射流的机械纤维化工艺在提取过程中的污染风险较低，因此材料纯度更高。
图1.用于外周神经刺激的基于 CSNF 的电极的制造工艺。a CSNF 纸电极制造工艺示意图。b、c 激光图案化 PI 掩模图像。PI 掩模通过激光烧蚀工艺直接图案化（b），过滤后轻轻去除以制造 CNT 微图案（c）。d、e CSNF 的 AFM 图像（d）和 CSNF 上的 CNT 网络（e）。f 用于体内实验的 CSNF 纸电极图像。g、h 用于体内实验的电极表面拓扑的激光扫描 3D 图像。i 未钝化的图案化纸电极示例。比例尺：（b）5 毫米，（f）2.5 毫米（g、h）100 微米（i）1 厘米。
我们使用 CNT 作为电极材料。CNT 因其高电荷转移特性、宽水窗和高生物相容性而被用作刺激电极。为了对电极进行微图案化，使用激光烧蚀系统在聚酰亚胺 (PI) 薄膜中制造孔和凹槽（图 1b）。为了在纳米纤维纸上高产量地制造出完美无瑕的导电微图案，我们主要使用 25 µm 厚的 PI 掩模。它们足够坚硬，可以在处理过程中保持平整，从而使纸和掩模之间实现保形接触。通过 PI 薄膜掩模过滤 CNT 分散体会在 CSNF 纸顶部产生过滤后的电极微图案。随后，我们移除 PI 掩模并放置聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 掩模以覆盖接触垫区域。随后，CSNF 分散体的第二次过滤产生了一个钝化层来覆盖导电图案。
这种使用激光图案化 PI 掩模的全过滤工艺不需要标准的光刻技术来在纳米纤维纸顶部对电极进行微图案化。需要注意的是，定位和移除 PI 薄膜掩模的时机对于获得 CNT 和 CSNF 之间的良好粘附至关重要。由于干燥的 CSNF 纸导致与 PI 掩模表面的附着力较弱，因此我们在第一次过滤 CSNF 纸后直接放置了掩模。此外，由于干燥的馈线和电极结构与 CSNF 纸的粘附性更好，我们在过滤 CNT 分散体几分钟后小心地取下了掩模（图 1c）。为了方便去除掩模，除了电极结构外，我们还在 PI 掩模中引入了其他图案。这些图案降低了纸张和 PI 之间的粘附力，从而可以干净地去除掩模。
对 CSNF 基质的原子力显微镜 (AFM) 分析表明，直径约为 20-50 nm 的个体化壳聚糖纳米纤维缠结在一起形成纸表面（图 1d）。CSNF 基质的均方根 (Rq) 表面粗糙度为 ~ 126 nm。图 1e 中的 CNT/CSNF 电极的 AFM 图像显示表面粗糙度为 Rq = ~ 152 nm。图 1f 显示了用于神经刺激的 2 探针 CNT/CSNF 电极。图案化电极材料的平均表面积为 1.75 ± 0.02 mm^(2)（n = 24），2 条电极馈线（宽 200 µm，长 300 µm）夹在 2 个 15 µm 厚的 CSNF 层之间。图中是电极表面拓扑的 3D 图像。1g、h 显示了去除 PDMS 掩模后电极与纳米纤维纸上完整 CNT 馈线的界面。尽管 PDMS 以前用于在过滤膜上捕获图案化纳米线但我们在这里专门用它来覆盖纳米纤维分散体过滤过程中接触垫和电极的区域。由于干燥过程会导致不受约束的电极变形和卷曲，因此将基板夹在 2 个玻璃片之间，并在约 832 Pa 下热压几分钟以保持其平整。该制造工艺适用于任意图案（图 1i）。
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2.2 CNT/CSNF 电极的电气和几何特性
我们对 CSNF 纸上的 CNT 馈线进行了电气和几何特性分析。为了在特性分析过程中暴露电极，我们跳过了形成钝化层的过程（附加文件 1：图 S1）。图 2a 显示了宽度从 100 µm 到 1000 µm 不等、长度为 1 cm 的 CNT 馈线。CNT 馈线的 SEM 图像（图 2b）表明，CNT 网络组装在纳米纤维纸上，与 PI 掩模中的激光微图案相对应。此外，我们使用 CNT 制作了细馈线。如图 2c-e 所示，馈线的最小宽度达到小于 25 µm，这与激光烧蚀的单个光斑尺寸相似。CSNF 纸顶部馈线的几何分辨率由激光系统的精度决定。
图2.嵌入 CSNF 纸中的 CNT 馈线的特征。a 宽度分别为 100-1000 µm 和 1 cm 的 CNT 馈线。b CNT 网络和 CSNF 纸基之间的边界的 SEM 图像。c 宽度为 25 µm 的 CNT 馈线。d、e 图像 (c) 的 SEM 图像。f、g CNT 馈线的厚度和电导取决于不同的表面密度（黑点：0.2 mg cm-2，灰点：0.1 mg cm-2，白点：0.05 mg cm-2）和馈线宽度。平均厚度（n = 18，平均值±标准差）（f）和 CNT 馈线的电导（n = 3，平均值±标准差）（g）。比例尺：a、c 1 mm，b 5 µm，d、e 10 µm。
图 2f、2g 分别绘制了 CNT 馈线的平均厚度和电导率与宽度的关系。馈线的厚度与馈线的宽度无关（图 2f）。该结果表明，无论图案的形状如何，CNT 分散得足够好，可以在 CSNF 纸上产生均匀的 CNT 网络。正如预期的那样，较厚的 CNT 网络表现出更高的电导率。变化几乎与馈线的宽度和 CNT 网络的表面密度成线性比例（图 2g）。因此，我们确认图案化 CNT 网络的电导率仅由面积和 CNT 分散量控制。0.20 mg cm^(−2) 的 CNT 馈线的电导率为 1064 ± 170 S m^(−1) (n = 10，平均值±标准分)，明显高于先前使用 PDMS 基板的研究报告值 (173 ± 27 S m^(−1))。电导率的提高可能源于使用硬掩模和不同基板材料进行直接图案化。通常，高纵横比导电材料网络从膜过滤器转移到基板可能会导致电极机械损坏（例如裂纹）并降低导电材料网络的电导率。相反，本制造工艺利用直接在基板上对导电材料网络进行微图案化。
2.3 嵌入 CSNF 基板的其他导电材料
所提出的基于过滤的制造工艺适用于其他类型的高纵横比导电材料。图 3a、b 中的 SEM 图像显示了在 CSNF 纸上过滤和组装的银纳米线 (AgNW)。显然，可以在 AgNW 网络中找到羧甲基纤维素 (CMC) 的聚集体（图 3b）。对于 AgNW 的过滤，将它们分散在水中，并添加 CMC 作为增稠剂和润滑剂，以保持 AgNW 网络嵌入并与 CSNF 基板良好连接。此外，CMC 和 CSNF 之间的静电相互作用增强了它们的相互粘附，因为 CMC 和 CSNF 分别是聚阴离子和聚阳离子。由于 AgNW 网络中的 CMC，我们成功地在 AgNW 微图案上产生了钝化层，而不会分离图案化的 AgNW。图 3c 显示，AgNW 网络的电导率可以简单地通过馈线面积和 AgNW 分散量来控制，类似于 CNT 图案。与 CNT 网络相比，AgNW 图案的电导率大约提高了两个数量级。尽管 AgNW 由于释放银离子而具有较低的生物相容性，但这种基于过滤的简便图案化工艺适用于大规模纸质电子产品或可拉伸电子产品。
图3.嵌入 CSNF 基底的各种导电材料的特性。a AgNW 网络与 CSNF 纸之间边界的 SEM 图像。b 纠缠在 AgNW 网络中的羧甲基纤维素纳米纤维聚集体。c 具有不同表面密度的 AgNW 馈线的电导率（黑点：0.2 mg cm^(-2)，灰点：0.1 mg cm^(-2)，白点：0.05 mg cm^(-2)，n = 6，平均值±标准差）。d、e PEDOT:PSS 与 CSNF 基底 d 之间以及 CNT/PEDOT:PSS 复合材料与 CSNF 基底之间边界的 SEM 图像。f CNT（圆点）、PEDOT:PSS（三角点）和 CNT/PEDOT:PSS 复合馈线（菱形点）的电导率。（n = 5，平均值±标准差）。比例尺：a、d、e 5 µm，（b）2 µm。
我们进一步研究了该工艺在 CSNF 上图案化导电聚合物 PEDOT:PSS 的适用性。PEDOT:PSS 是最有前途的生物电子学和柔性器件导电聚合物之一。原始 PEDOT:PSS 水溶液通过 PI 掩模过滤导致在 CSNF 基底上形成微图案。图 3d 中的 SEM 图像显示了沉积的 PEDOT:PSS 的相对光滑的表面。我们在馈线表面观察到一些与其长轴平行的皱纹，靠近馈线的边缘（附加文件 2：图 S2b）。相反，如果没有 CSNF，PEDOT:PSS 就不会被困在 PVDF 膜上，这意味着 CSNF 纸的孔隙充当了过滤器来捕获原始 PEDOT:PSS。通过动态光散射测量发现，PEDOT:PSS 粒子的平均尺寸在 50 至 600 纳米之间，这使得粒子能够被捕获在纸基中。传统上，PEDOT:PSS 是使用滤膜直接过滤以产生导电膜的，方法是使用特定溶剂使 PEDOT:PSS 纳米粒子聚集到大尺寸。另一方面，纸基已用于过滤金纳米片、罗丹明 和 SIV 病毒等材料。因此，这种过滤过程与多种材料兼容是合理的。在这项研究中，PEDOT:PSS 的微图案以无化学且简便的方式生成，无需进一步修改，仅使用原始 PEDOT:PSS 和去离子水。
与纯 CNT 或 PEDOT:PSS 相比，CNT 和 PEDOT:PSS 混合物同时过滤会改变其表面形貌和电导率。图 3e 中的 SEM 图像显示了 CNT/PEDOT:PSS 复合材料馈线的表面。结构沉积并组装在纳米纤维顶部，过滤过程中不会发生相分离。与图 2b 所示的裸 CNT 相比，CNT/PEDOT:PSS 的表面相对光滑。此外，与纯 PEDOT:PSS 相比，表面的裂纹和皱纹更少（附加文件 2：图 S2c）。此外，向 PEDOT:PSS 中添加 CNT 可提高电导率。如图 3f 所示，密度为 0.4 mg cm^(-2) 的 PEDOT:PSS 馈线的电导率与密度为 0.05 mg cm^(-2) 的 CNT 网络的电导率几乎相同。当我们过滤密度分别为 0.4 mg cm^(-2) 和 0.05 mg cm^(-2) 的 CNT 和 PEDOT:PSS 混合物时，电导率比原始 CNT 网络或 PEDOT:PSS 高三倍。电导率的非线性增加和光滑表面与之前的报告非常吻合，这些报告表明 CNT 复合材料的电导率与 CNT 的浓度不成比例。如前所述 ，由于聚合物与 CNT 的相互作用，CNT/PEDOT:PSS 复合材料表现出光滑的表面和改进的机械特性，包括较低的拉伸强度和较大的断裂伸长率。
2.4 CNT/CSNF 电极的机械和电化学特性
我们对 CNT/CSNF 电极进行了额外的机械和电化学特性分析，以了解其作为生物电子接口的潜在应用。首先，我们研究了制备的 CNT/CSNF 电极的机械特性（图 4a）。CNT/CSNF 电极具有高度的柔韧性，因此可以通过扭转它们弯曲并缠绕在玻璃棒上（图 4b）。这种柔韧性是生物电子设备的重要特性之一，可实现自身的机械变形，并赋予生物电子接口与生物组织的共形接触。电极断裂前的最大应变为 6.1±1.8 [%] (n=4)（图 4c）。该结果表明，与其他纤维素纳米纤维基材相比，该电极可以承受相对较大的应变。为了评估电极作为生物电子接口的潜在应用的机械性能，我们进行了额外的实验来研究电极在机械变形下的相对电阻。首先，我们测量了电极在缠绕玻璃棒之前和缠绕过程中的电阻（图 4d）。此外，我们制备了具有六种不同表面密度的 CNT/CSNF 电极，以查看电极的表面密度是否会影响施加这种机械变形所引起的电阻变化。观察到的电阻变化（R/Ro）不受不同表面密度的强烈影响（图 4e，f）。此外，无论表面密度如何，R/Ro 的值都不会因玻璃棒的直径而发生严重变化。该结果与之前的报道相符，在该报道中，嵌入纤维素纳米纤维纸中的 AgNW 网络的电阻在多次折叠过程中没有发生强烈变化。因此，我们假设缠结的 CNT 网络结构具有足够的柔韧性，以在机械变形过程中保持其电导率。
图4.CNT/CSNF 电极对机械变形的阻力变化。a 为体内实验制作的 CNT/CSNF 电极图像。b 将电极弯曲并缠绕在玻璃棒（直径 1 毫米）上。c CNT/CSNF 电极的示例应力-应变曲线。d CNT/CSNF 电极在缠绕玻璃棒之前和缠绕过程中的电阻测量示意图。e、f 具有不同表面密度的 CNT 和 CSNF 缠绕在玻璃棒上的 CNT/CSNF 电极的相对电阻（n=3，平均值±标准差）。CNT 的表面密度分别为 0.03 mg cm-2（e）和 0.06 mg cm-2（f），电极具有三种 CSNF 密度：4.5 mg cm-2（白点）、9.0 mg cm-2（灰点）和 13.5 mg cm.-2（黑点）。g CNT/CSNF 电极的相对电阻随弯曲循环次数的变化（n = 3，平均值±标准差）。h CNT/CSNF 电极在应变施加过程中的相对电阻（n = 4，平均值±标准差）。
其次，我们测量了 CNT/CSNF 电极在重复弯曲下的电阻（图 4g）。与嵌入 AgNW 的 TEMPO 纤维素纳米纤维纸相比，在多次弯曲循环中观察到的电极电阻相对变化相当低。此外，与 Ti/Au 蒸发的纤维素纳米纤维相比，在中等应变下电阻相当稳定（图 4h）。我们将相对电阻的稳定性归因于电极的钝化层，该钝化层将 CNT 网络嵌入 CSNF 基底和钝化层中。
接下来，我们研究了 CNT/CSNF 电极的电化学特性。在实验之前，我们用聚氨酯 (PU) 覆盖电极的引线以进行钝化。PU 已广泛用于绝缘植入式电极，同时保持生物相容性和柔韧性。图 5a 显示了对 Ag/AgCl 在 −2.0 V 至 2.0 V 范围内的循环伏安法 (CV) 测量结果。发现 CNT 电极的水氧化和还原极限分别约为 +1.5 V 和 −1.5 V。我们的 CNT 电极的水窗口与以前使用 CNT 作为电极上导电材料的工作中的水窗口相对应。这种大的水窗口的优点是电极可以极化到高电位，而不会发生不可逆法拉第反应，从而避免引起不良副作用，例如 pH 值变化、电极退化和组织损伤。如图 5b 所示，电极在 1.0 kHz 时的阻抗值为 6.7±1.3 kΩ（n=8，平均值±标准差）。PBS 中的 CNT/CSNF 电极的阻抗和相位与先前研究报告的结果相似，证实了它们适用于神经刺激电极。
图5.CNT/CSNF 电极的电化学表征。a CNT/CSNF 电极的循环伏安图从 -2 V 扫描至 2 V vs Ag/AgCl 以确定水窗口。b 电极的阻抗谱（n = 8，平均值±标准差）。
2.5 体内实验
作为原理验证，我们用蝗虫进行了体内实验。由于蝗虫具有有趣且易于接近的神经系统，因此已被用作神经生物学研究中的模型生物。我们实验中蝗虫的目标组织是中胸神经节中的快速伸肌神经 (N5)，因为 N5 支配后腿的伸展和屈曲（图 6a）。如图 6b 所示，我们将电极插入并连接到蝗虫的 N5。可以看出，PU 绝缘体未与蝗虫的 N5 接触。图 6c 中的示意图表示 N5 和电极之间的界面。在蝗虫手术、电极插入和刺激实验的整个过程中，我们没有观察到对神经及其周围组织的任何严重损伤。
图6.使用蝗虫进行电极的体内植入。a、b 蝗虫的 N5 图像。b CNT/CSNF 电极与蝗虫的 N5 接口。c CNT/CSNF 电极与蝗虫的 N5 接口的示意图。d 显示蝗虫胫骨伸展及其相应角度变化的图像。e 每 5 秒施加 220 µA 双双相脉冲期间测量的角度轨迹。f 刺激引起的蝗虫胫骨伸展的角度（n = 15，平均值±标准差）。
在这种配置下，我们通过施加双相电流脉冲刺激蝗虫的 N5。每次将双相电流脉冲施加到蝗虫的 N5 时，我们都会观察到蝗虫胫骨的伸展（图 6d）。图 6e 显示了每 5 秒施加一次双相脉冲时蝗虫胫骨的轨迹。我们观察到每次刺激后，屈肌收缩导致稳定伸展，随后缓慢屈曲。每次伸展都在几十分之一毫秒内观察到，这与蝗虫胫骨伸展由快速胫骨运动神经元调节的结果非常相似。该结果证实了通过 CNT/CSNF 电极刺激引起神经活动以伸展蝗虫胫骨的可能性。
伸展的角度根据施加的电流脉冲的幅度和脉冲数而变化（图 6f）。我们施加了由两个连续的单双相脉冲组成的双双相电流脉冲。当刺激幅度达到 200 µA 时，伸展角度会增加。这一结果表明，200 µA 的双双相脉冲足以引起最大腿部伸展。在施加 160 和 180 µA 的双双相脉冲时，我们有时会观察到胫骨快速弯曲或收缩，而不是通常的伸展，从而导致负角度。这些现象可能是由于蝗虫的随机生物行为而发生的。此外，我们将其归因于实验过程中蝗虫的某些运动导致电极与神经发生位移。此外，并非所有施加的电流都能到达目标组织，这取决于电极相对于神经的精确位置。为了在生物运动过程中获得更好的接触并产生稳定的刺激，我们认为应该将该电极开发为袖口电极，以在电极和生物组织之间提供更安全的界面。接下来，我们施加 200 µA 的单双相脉冲，发现伸展角度低于相同幅度的双双相脉冲。这一结果表明，每个双相脉冲的间隔有助于调节腿部伸展的角度，这与之前通过改变每个脉冲的间隔来调节蝗虫腿部运动的结果相符。总的来说，我们成功地用 CSNF/CNT 电极刺激了蝗虫的 N5，证明了植入电极的高生物相容性，并通过改变每次刺激中施加的双相脉冲的幅度和数量来调节伸展角度。
三、结论
我们建立了一种制造工艺，通过使用激光图案化 PI 掩模进行真空过滤，在 CSNF 基板上微图案化导电材料。我们证明了该工艺适用于高纵横比导电材料，例如碳纳米管和银纳米线以及基于 PEDOT:PSS 的导电聚合物。我们的研究结果为在纳米纤维纸上制造导电材料微图案提供了指导。最后，利用这种多功能的制造方法，我们制造了用于外周神经刺激的柔性 CNT/CSNF 电极，并对蝗虫的 N5 进行了体内实验。我们通过施加双相电流脉冲来调节蝗虫腿的伸展。我们相信，所提出的方法将有助于开发基于 CSNF 纸基板的未来柔性生物电子设备。
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