一、引言
能够可靠且有效地激活大脑皮层的神经假体，有潜力治疗多种神经系统和精神系统疾病。然而，鉴于大脑皮层内细胞类型的高度多样性，再加上无法有选择地靶向（或避开）特定细胞类型，实现有效的激活是很困难的。此外，来自大脑远处神经元的轴突对假体刺激高度敏感；这可能导致激活范围远远超出给定电极周围的局部区域，进而降低创造精确神经活动模式的能力。事实证明，使用植入电极随着时间推移保持反应一致性也颇具挑战性。例如，植入猕猴初级视觉皮层（V1）的电极在植入后不久都能可靠地引发视觉感知（光幻视），但个别电极在几个月内就会失去效果。尽管可以使用更大组的电极来产生光幻视，但将电极组合在一起的需求意味着潜在视敏度的显著损失。虽然这种性能下降的根本因素尚未完全明确，但已知植入大脑皮层会引发异物反应，其中可能包括炎症以及其他不良生物反应。单个电极周围神经胶质瘢痕的形成会改变甚至阻断由刺激诱导产生的电场，从而导致神经反应发生变化（甚至消失）。尽管有时可以通过增加刺激幅度来重新引发一些行为反应，但随之而来的功耗增加是有害的，尤其是对于打算长期植入的设备而言。
可植入微线圈的磁刺激与传统基于电极的刺激相比，具有几个潜在优势。例如，与电极产生的场不同，磁刺激产生的电场在空间上是不对称的，因此可以利用这一点有选择地激活某些神经元亚群，同时避开其他亚群。在大脑皮层中，这可能包括例如激活垂直取向的锥体神经元（PNs）而不激活水平取向的过路轴突的能力。微线圈的另一个潜在优势是，与电极引发的电场不同，磁场可以轻易穿过生物材料，因此即使被严重包裹，其功效也不会降低。第三个优势是，金属线圈与神经组织之间不存在直接接触，这使得基于线圈的刺激不太容易出现脑-电极界面可能出现的众多问题，例如，由于输送高水平电荷而对电极和/或周围组织造成的损害。此外，线圈可以完全用柔软的生物相容性材料进行绝缘处理，这些材料已被证明可以减轻大脑皮层对植入的反应。
尽管磁刺激的潜在益处早已为人所知，但人们普遍认为，小到足以植入大脑皮层的线圈无法产生足够强的场来调节神经元活动。几年前，科学家表明，一个直径为500微米、长1毫米的商用电感器可以调节中枢神经系统神经元的活动。他们进一步表明，可以利用电感器产生的场不对称性来有选择地激活某些类型的神经元，同时避开其他类型的神经元。尽管这令人鼓舞，但他们研究中使用的电感器的横截面轮廓仍然几乎是常用植入物的100倍，因此引发了人们对能否安全植入大脑皮层的担忧。尽管如此，用小线圈激活神经元的能力提出了一种可能性，即进一步减小线圈尺寸或许是可以实现的。新的、更高效的设计也可能有助于降低与微线圈相关的功率水平，尽管自最初的研究以来功率水平有所降低，但仍远高于电刺激的功率水平。
在此，为了探索小到足以安全植入的线圈的可行性，我们首先开发了一个计算模型，使我们能够快速评估新设计的潜在有效性。我们发现，微线的简单弯曲可以产生超过已知神经元激活阈值的场。制造出的原型在尺寸上与现有的电极植入物相当，因此，除了进行体外测试外，还可以安全地植入大脑皮层，以便在体内评估其驱动神经回路的能力。我们的结果有力地支持了可植入微线圈作为传统电极植入物的一种有吸引力的替代方案的可行性。
二、结果
01. 微线圈的计算建模
为了更好地了解小到足以植入的线圈是否能够激活大脑皮层神经元，我们对先前微线圈研究中使用的电感器单匝线圈产生的场进行了建模。线圈的尺寸为500微米×500微米，线径为10微米（图1A，左侧）。在推导出单匝线圈产生的磁场和电场后（材料与方法），我们计算了沿三个正交维度的电场梯度；已知沿神经元或轴突长度方向的梯度强度是激活的基础，因此显示线圈周围区域场梯度的表面图（图1A，中间）可用于快速评估潜在有效性。我们特别关注垂直于大脑皮层表面的梯度分量（使用图1的坐标轴表示为dEx/dx），因为这代表了激活垂直取向锥体神经元（PNs）的驱动力。在先前的研究中，通过线圈的刺激电流峰值幅度可能超过1安培，而在这里我们发现，1毫安的幅度产生的峰值场梯度约为50,000伏/平方米（图1A，右侧），这个值远高于先前报道的用经颅磁刺激线圈刺激外周轴突的11,000伏/平方米的阈值。因此，这表明即使是单匝排列适当的线圈也可能有效地激活锥体神经元。峰值场超过阈值的空间范围从线圈延伸约75微米（图1A，右上角），因此表明激活可能仅限于附近的几个细胞。对于图1A中线圈的取向，平行于第1层和第4层过路轴突的梯度分量（dEz/dz）为0伏/平方米（图1A，右下角），这表明那些轴突或类似取向的突起不会被激活。
图1 微米级微线圈产生超阈值场
（A）由左侧500微米方形线圈（红色）产生的x方向电场梯度（dEx/dx）的表面图（中间）。请注意，表面图中水平方向的峰值表示垂直于大脑皮层表面方向上的峰值梯度，即在左侧大脑皮层柱表示图中的上下方向。右侧：垂直方向（dEx/dx，上方）和水平方向（dEz/dz，下方）梯度的二维分布图；横坐标上的“0”对应于线圈的右下角。水平线表示早期使用大得多的线圈进行研究时估计的阈值水平（见正文）。垂直虚线表示超阈值区域的宽度。（B）与（A）类似，只是使用的是一个100微米的梯形线圈。
图1A中所示的线圈仍然比现有的大脑皮层植入物大得多，所以我们探究了更小的设计是否也能产生超阈值场和梯度。与电磁理论一致，dEx/dx的峰值位于线圈的角落，也就是电流流动中有急剧弯曲的区域，因此我们考虑了这样一种可能性，即哪怕是单根导线的一次急剧弯曲也可能产生足够强的场和梯度来实现激活。因此，我们考虑了图1B的设计（左侧，红色粗线）。这个线圈100微米的宽度适合放入单个大脑皮层柱内，并且在尺寸上与现有的电极植入物相当，这表明它可以安全地植入大脑皮层。为这个线圈计算出的场梯度峰值强度为49千伏/平方米（图1B，中间和右侧面板），几乎与更大的单匝线圈的强度相同；对于1毫安的刺激，梯度超过阈值的空间范围同样很窄，仅延伸约60微米。
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尽管图1中估计的激活空间狭窄区域对于需要局部激活的应用极具吸引力，但众所周知，长期植入大脑皮层会引发异物反应，这可能导致在植入物周围形成高阻抗的神经胶质鞘，从而导致与目标神经元的距离增加。作为异物反应的一部分，神经元也可能从植入物处迁移，甚至对于不进行刺激的植入物，也有报道称迁移距离约为75微米。与存活神经元距离的增加提出了这样一种可能性，即由低幅度刺激产生的空间狭窄的场和梯度可能延伸得不够远，以至于在长期植入后线圈无法保持有效。因此，我们研究了通过改变刺激幅度，感应场和梯度的空间范围是如何变化的。我们首先更仔细地研究了与图1中相同的1毫安刺激下的场和梯度分布图。针对穿过线圈的多个垂直和水平截面，分别生成了场和垂直梯度（dEx/dx）的一维图（分别见图2A和B；每个梯度图中的红色虚线表示先前报道的11,000伏/平方米的阈值水平）。梯度超过阈值的曲线部分提供了激活可能发生的大致范围的估计值。由于激活将仅限于线圈周边外部的那些区域，我们将注意力集中在图2A中蓝色虚线左侧的区域以及图2B中两条蓝色垂直虚线外部的区域。通过这种方法，对于1毫安的刺激，沿x轴提取的dEx/dx部分绘制在图2C中（黑色），而沿y轴的dEx/dx相关部分绘制在图2D中（黑色）。我们对更大的刺激幅度（10、25、50和100毫安）进行了类似的分析，并叠加了相应的曲线（分别为红色、蓝色、绿色和粉色）。对各个图的比较不仅表明超阈值区域随着幅度的增加而增大，而且还表明它在x和y方向上是不对称的；例如，对于100毫安的幅度，超阈值区域沿x轴延伸约151微米，沿y轴延伸414微米。为了更好地直观显示这个区域的全貌，我们为所有幅度绘制了二维等高线图（图2E）。这些图证实了该区域对幅度变化的敏感性，以及对于更高的刺激幅度，场梯度超阈值的相对较宽的空间范围。请注意，即使是图2中使用的最大刺激幅度也远低于最初体外和体内研究中使用的水平。因此，模型结果表明，植入的微线圈将能够在一个空间广阔的区域内有效地激活神经元，例如，超出神经胶质增生和细胞迁移发生的范围。因为磁场甚至可以轻易穿过高阻抗材料，所以植入的线圈到达这些更远区域的能力可能不会受到严重神经胶质增生的不利影响，而电极却可能会受到这种影响。
图2 超阈值场的区域随着电流幅度的增加而扩大
（A）对于穿过微线圈的三个不同垂直横截面，沿x轴方向绘制由微线圈（左侧）产生的x方向电场（中间）和场梯度（右侧）（dEx/dx）的图。梯度图中的红色虚线表示早期使用经颅磁刺激线圈进行研究时估计的阈值水平（见正文）。
（B）对于三个水平横截面，沿y轴方向绘制x方向电场（中间）和空间梯度（下方）（dEx/dx）的图。
（C）对于x≥0的值，沿x轴提取不同幅度下场梯度分布图的相应部分。
（D）与（C）类似，但对于y≤0的值，沿y轴提取场梯度分布图的相应部分。
（E）不同电流幅度下超阈值梯度区域的等高线图。
02. 微线圈探针的制作和体外实验
为了验证新型微线圈能否激活大脑皮层神经元，我们通过微加工制作了图1B所示的线圈设计，用于生理实验（材料与方法；图3A）。该线圈由硅基片上的一条铜迹线（宽10微米×厚2微米）组成，其横截面积为50微米×100微米，长度为2000微米。线圈组件的直流电阻约为15欧姆，并用300纳米的二氧化硅进行绝缘处理（材料与方法），以防止电流泄漏到组织中。还通过小心地弯曲一根直径为50微米的铜线，制作了第二个尺寸相近的微线圈（图3B）。尽管第二个线圈的弯曲程度不如微加工制作的线圈那么尖锐，但铜线较厚的横截面积允许通过更强的电流。5微米的聚氨酯/聚酰胺绝缘层防止了第二个线圈的电流泄漏到浴液或组织中。它的电阻约为13欧姆。
图3 微线圈在体外激活大脑皮层锥体神经元（PNs）
（A）由硅基片（黄色）上的铜迹线（红色）组成的微加工线圈示意图。
（B）弯线微线圈的图示。50微米的铜线（红色）被5微米的聚氨酯/聚酰胺绝缘层包围。
（C）在存在突触阻断剂（上方曲线）和添加河豚毒素（TTX）（下方曲线）的情况下，对亚阈值（左侧）和超阈值刺激（右侧）的反应。蓝色曲线是通过从上方面板的相应曲线中减去添加TTX后的曲线计算得出的。星号表示诱发的动作电位。
（D）也可以在不使用TTX的情况下，通过从有尖峰（假定存在尖峰）的反应中减去无尖峰（仅为伪迹）的反应来提取动作电位；黑色曲线就是这样一个尖峰[来自与（C）不同的细胞]。来自同一细胞的自发尖峰被叠加（绿色）。
（E）体外实验装置示意图。使用细胞贴附式膜片电极从触须（运动）皮层中第5层（L5）锥体神经元的胞体记录对微线圈刺激的反应；线圈的长轴可以垂直于切片表面放置（上方），也可以平行于切片表面放置（下方）。在所有情况下，线圈的尖端都位于近端轴突上方。红色虚线和实线水平箭头分别表示沿轴突长度方向诱导的弱电场和强电场。AIS，轴突起始段。
（F）每种取向的典型反应。以100赫兹的频率进行刺激；刺激伪迹表示每个脉冲的时间。在下方曲线中每个脉冲后看到的明显的超极化后电位是诱发尖峰的可靠指标。
（G）在对照人工脑脊液（aCSF）（左侧，n = 7个细胞）和添加突触阻断剂（右侧，n = 4个细胞）的情况下，诱发动作电位的概率作为刺激电流幅度的函数。
（H）对于在11个单个神经元中以100赫兹连续传递的10个脉冲，绘制诱发尖峰的起始潜伏期。所有尖峰都在刺激开始后0.3至0.7毫秒内被诱发。
（I）与（H）相同，但在灌注浴液中添加了突触阻断剂（n = 4个细胞）。
（J）实验装置示意图，显示线圈以垂直（上方）或平行（下方）取向放置在顶端树突上方。
（K）每种取向对顶端树突刺激的典型反应。红色水平条表示施加刺激的持续时间。
在体外实验中，首先使用小鼠的冠状脑切片测试了制作的微线圈激活大脑皮层神经元的能力（材料与方法；图3，C至K）。将一个松散密封的细胞贴附式膜片钳电极放置在触须（运动）皮层内目标第5层（L5）锥体神经元的胞体上，并用于记录由微线圈磁刺激诱发的动作电位（材料与方法）。在先前的电刺激研究中，膜片钳记录已被证明能有效地显示诱发的动作电位，因为放大器不会被刺激饱和；例如，与刺激相关的电伪迹不会妨碍对神经元反应的观察。将线圈放置在靠近目标细胞的位置，尖端位于近端轴突的中心上方，近端轴突被认为是细胞对刺激最敏感的部分。为了确保观察到的反应是由细胞本身的直接激活引起的，也就是说，不是由于一个或多个突触前神经元的激活而产生的次级反应，在一些实验中，我们向灌注浴液中添加了10微摩尔的2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔啉（NBQX）、10微摩尔的荷包牡丹碱和50微摩尔的d-2-氨基-5-磷酸戊酸（d-APV），以阻断细胞的突触输入。在相对较低的幅度水平下进行刺激会产生一个电伪迹，它由一个持续时间较短的双相波形组成，持续时间约为0.4毫秒（图3C，左上方）。稍微增加刺激幅度会产生类似的伪迹，但现在会持续形成一个更长时间的波形（图3C，右上方）。向浴液中添加1微摩尔的河豚毒素（TTX）消除了反应的持续部分（图3C，右下方，红色曲线），这表明它是一个动作电位，并且从相应的对照反应中减去添加TTX后的反应，得到了一个波形（蓝色曲线），该波形与自发产生的动作电位高度相似。也可以从原始记录中（不使用TTX）提取诱发的动作电位，方法是从包含伪迹和动作电位的反应中减去仅包含伪迹的反应（图3D，黑色）；这个过程得到的波形在幅度和动力学上再次与自发动作电位的波形几乎相同（图3D，绿色曲线）。这表明用于识别动作电位的直接相减方法与使用TTX的效果相当。总之，这些实验表明，微线圈的磁刺激可以通过直接激活L5锥体神经元来诱发动作电位。
为了探究线圈选择性靶向神经元的能力，我们进行了实验，改变线圈相对于目标锥体神经元的取向。最初，将线圈平面保持垂直于切片表面（图3E，上方），导致沿着神经元长度方向产生一个弱电场和梯度。正如预期的那样，这种配置是无效的（图3F，上方），即使是我们的系统能够提供的最强幅度也是如此。然后将线圈重新取向，使其平面大致平行于切片表面（图3E，下方）；这种取向类似于将微线圈插入完整大脑皮层时的取向，并且沿着神经元长度方向产生了一个强梯度，从而导致了强烈的放电（图3F，下方）；请注意，每个刺激后紧接着出现的正向超极化后电位为诱发动作电位的存在提供了一个明显的标志。通过直接激活，即使在测试的最快频率（高达100赫兹；11个中有11个；图3F，下方）下，单个刺激也可以各自诱发一个动作电位。与电刺激类似，更强水平的磁刺激增加了给定脉冲诱发尖峰的可能性（图3G，左侧；n = 7），并显示出直接激活的阈值为44.21±7.31毫安（标准差）。向灌注浴液中添加突触阻断剂对这些细胞对刺激的敏感性没有显著影响（图3G，右侧；n = 4）。提取和显示单个尖峰的能力也使得能够精确确定单个尖峰的时间，并揭示起始潜伏期≤1.0毫秒（图3H）。正如对直接激活的尖峰所预期的那样，潜伏期对添加突触阻断剂不敏感（图3I）。
将线圈重新定位，使其尖端位于目标神经元的顶端树突上方（图3J），这样也可以探究神经元这一部分的敏感性。同样，将线圈平面垂直于切片表面取向（图3J，上方）会导致沿着神经元的电场非常弱，并且不会产生放电（图3K，上方）。然而，将线圈与切片表面平行排列（图3J，下方）会产生强烈的放电（n = 8；图3K，下方）。由顶端树突刺激诱发的尖峰的起始潜伏期与单个刺激的相关性不佳，通常≥3毫秒，这表明尖峰是通过周围神经网络的激活介导的。向灌注浴液中添加兴奋性突触输入的药理学阻断剂[10微摩尔的6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX）和50微摩尔的d-APV]消除了这些反应，从而证实了它们的突触前起源。间接激活的阈值为46.50±11.78毫安（标准差），因此两种激活模式的阈值相似。与先前的电刺激研究一致，即使在最高刺激幅度下，也不可能通过间接激活为每个刺激诱发一个单独的动作电位。我们没有尝试确定由顶端树突刺激激活的特定突触前神经元，但L5锥体神经元对垂直取向电场的高敏感性提出了另一个垂直取向神经元被激活的可能性；L2/3锥体神经元是一个明显的可能性，特别是因为已知它们与L5锥体神经元形成兴奋性突触。当然，微线圈的刺激可能会激活多种神经元类型，需要进一步测试来确定被激活的具体类型，并阐明随后发生的突触相互作用。
对于直接激活，当线圈的尖端位于距离胞体约50微米的近端轴突上方时，阈值通常是最低的。先前的电刺激研究表明，当电极精确地位于近端轴突的尖峰起始区内密集的钠通道带上方时，直接激活的阈值最小化，这里阈值最低很可能是因为靠近这个位置。然而，我们通常不会花费大量时间和精力来确定阈值最小化的确切位置，所以这里报告的44.21毫安的值可能并不代表可以获得的绝对最小阈值。对于间接激活，当线圈位于距离胞体约200微米的顶端树突上方时，阈值通常是最低的，不过同样我们也没有系统地尝试找到阈值最小化的位置。尽管这里得到的值不一定代表绝对最小阈值，但这里报告的水平仍然远低于先前用于体外激活的微线圈所报告的值。例如，先前使用原始微线圈（电感器）的研究需要较高的激活阈值 ，而这里体外激活的阈值为44.21毫安 。这里观察到的较低阈值水平可能是因为线圈尺寸较小，不仅产生了更强的场，而且能够更靠近目标神经元。还要注意的是，对于通过间接激活产生的反应（图3K，下方），由刺激产生的电伪迹相当小。这与感应电场的空间狭窄范围（图2）以及线圈和记录电极之间相对较大的距离是一致的。将刺激伪迹最小化是一个非常有吸引力的特性，特别是对于那些必须记录对人工刺激的反应的研究工作。
为了更好地探究磁刺激的空间范围以及其选择性激活特定取向的能力，我们使用表达GCaMP6的小鼠的脑切片进行了另一系列实验（材料与方法）。这些动物的大脑皮层锥体神经元表达一种钙指示剂，它会在细胞放电时增加荧光水平；与先前的报告类似，我们在单个L5锥体神经元的胞体中观察到了低水平的荧光（图4，A和C）。在测量对磁刺激的反应之前，我们首先检查了通过传统可植入电极进行电刺激所产生的反应（材料与方法）。在低水平的刺激下，荧光几乎没有变化，但随着刺激幅度的增加，荧光增加的区域逐渐变大（图4B）；这与先前体内电刺激研究的结果一致。在这里测试的最高刺激水平下，切片上一个200微米×200微米的区域被强烈激活，并且在各个方向上均匀扩展。与电刺激类似，低水平的磁刺激也几乎不会使荧光水平发生变化，而较高水平的磁刺激会导致激活区域逐渐增大（图4D）。然而，磁刺激的激活空间范围更狭窄，并且细胞被激活的位置与计算建模得出的预测结果一致（图2和图4F）。尽管图4（B和D）中显示的反应反映了胞体和周围神经纤维网（即轴突和树突）的荧光，但分析也可以仅限于评估胞体中的荧光变化。对于这里测试的最强刺激（52毫安），距离线圈最远达160微米的胞体显示出荧光的显著增加（ΔF/F > 5%至10%）（图4E），而距离更远的细胞也显示出荧光的较小增加（ΔF/F > 1%至3%）。因此，与图2E的建模预测一致，这些线圈的磁刺激可以在远远超出预期发生包封和细胞迁移的区域内调节活动，这表明这些线圈在长期植入期间可以保持有效性。
图4 兴奋空间范围的比较
（A）位于Thy1-GCaMP6f转基因小鼠初级视觉皮层（V1）冠状切片上方的微电极的光学显微镜照片。可以观察到第5层（L5）单个神经元的胞体。
（B）对来自电极的三种不同刺激水平的荧光变化反应。电极的尖端在每个图像的顶部显示为一个向下的三角形。黄色三角形和虚线表示大脑皮层柱的大致方向。
（C）与（A）类似，显示了植入在V1切片上方的微线圈。在图像的顶部可以看到线圈大致呈半圆形的尖端。
（D）对三种不同水平磁刺激的荧光变化反应。
（E）根据胞体轮廓为单个锥体神经元（PNs）定义了一个感兴趣区域（ROI），并用于计算每个细胞中的细胞钙荧光瞬变。红色神经元显示出强烈的钙瞬变（ΔF/F > 5%）；黄色和绿色神经元分别表示中等（ΔF/F > 3%）和微弱的钙瞬变（ΔF/F > 1%）。蓝色神经元表示钙荧光没有可观察到的增加。
（F）示意图，说明预计会被线圈刺激激活的锥体神经元（PNs）所在的区域。位置A处（蓝色胞体）的锥体神经元的近端轴突与感应场梯度（沿神经元长度方向）超过阈值的区域（黄色圆形区域）对齐；其他神经元（位置B，红色胞体）的顶端树突也延伸到超阈值区域并同样被激活；而没有延伸到强梯度区域（位置C，绿色胞体）的神经元突起则不会被激活。
（G）（F）中所示的L5锥体神经元的平均钙瞬变反应。
为了排除非磁性因素对在此观察到的放电反应有影响的可能性，我们进行了一系列对照实验，类似于早期研究中对更大的微线圈所做的实验。例如，通过测量对地阻抗来定期测试线圈绝缘的完整性；数值通常约为1吉欧姆，且始终大于200兆欧姆，从而排除了直接电刺激对观察到的反应有影响的可能性。我们还在磁刺激过程中监测了浴液以及周围脑组织的温度，观察到温度升高小于1摄氏度，远低于神经元热激活的阈值。电容电流可以通过线圈绝缘层传输，并且先前已被证明对神经元激活有效。然而，在我们的实验中记录室里没有回路电极，因此电流不会像先前的一项研究中那样“强制”通过组织。尽管这大大降低了电容激活的潜在可能性，但我们还是进行了一个对照实验，在该实验中，使用一个大的瞬态电流来“烧毁”线圈的一小部分，从而形成开路；瞬态电流不够强，不足以烧毁周围的绝缘层，因此不存在直接电激活的可能性。随后对“损坏”的线圈进行刺激，在开路两端产生了电位差，基本上起到了电容器的作用。然而，这种方法对于引发神经活动是无效的，因此表明观察到的反应不是通过电容激活介导的。最后，为了排除我们实验装置中的一个或多个（非线圈）硬件元件可能产生导致神经元激活的场的可能性，在所有实验中都小心地将所有硬件组件固定在一个位置。通过这种方式，在所有试验中唯一在空间位置上不固定的组件是线圈相对于目标细胞的取向。因为一些实验诱发了神经元反应，而另一些则没有，所以任何非线圈硬件组件都不太可能对激活有实质性的贡献，我们得出结论，来自取向适当的微线圈的场是激活的主要来源。
03. 体内动物实验
基于在体外成功激活了锥体神经元（PNs），我们将新型线圈植入到麻醉小鼠的触须（运动）皮层中，以探究它们是否也能在体内驱动神经回路。在进行颅骨切开术并去除硬脑膜后（材料与方法），两种线圈设计（图3，A和B）都可以轻松地插入大脑皮层（分别为n = 18和n = 6）。在随后长达2小时的实验过程中，没有出现过度出血或其他并发症的迹象。将线圈尖端插入到大约500微米的深度，使尖端与L5锥体神经元高度敏感的近端轴突对齐，并采用在体外实验中最有效的线圈取向（图3C，下方）。触须皮层是评估体内功效的一个有吸引力的目标，因为它可以将结果与许多早期使用植入电极的研究进行直接比较。例如，与电刺激的结果类似，触须运动的方向对磁刺激的频率同样敏感：对左侧半球触须运动皮层进行10赫兹的刺激（5个脉冲；图5A，左侧）可靠地使右侧触须前伸（图5B，右上方，向上的偏转；8个中有8个），而100赫兹的刺激（10个脉冲；图5A，右侧）导致触须回缩（图5B，右下方，向下的偏转；8个中有8个）。也与电刺激反应类似，对磁刺激作出反应的触须前伸的起始速度比对触须回缩的起始速度慢（图5E；n = 5；t检验，P = 0.0008）。尽管在麻醉动物中诱发的运动幅度较小，但它们在大小上与先前在麻醉动物中用电刺激诱发的运动幅度相当。在某些情况下，随着麻醉开始消退，我们观察到了更大的偏转，尽管我们没有试图量化这些差异。两种线圈都得到了定性相似的结果。
图5 植入的微线圈在体内激活神经回路
（A）刺激波形包括以10赫兹频率传递的5个脉冲，或者以100赫兹频率传递的10个脉冲。每个脉冲由一个振幅为112毫伏、频率为3千赫兹的正弦波的一个完整周期组成。
（B）左侧：将线圈插入触须运动皮层（左侧半球）。10赫兹的刺激导致右侧触须前伸（向上偏转）（上方），而100赫兹的刺激引发触须回缩（向下偏转）（下方）。
（C）模拟触须感觉皮层的线圈插入大致位置的图示。10赫兹和100赫兹的刺激都导致触须回缩（右侧的上方和下方面板）。
（D）每种刺激条件下触须运动峰值的平均幅度。
（E）每种刺激条件下触须运动起始的平均潜伏期。
为了证实可植入线圈对于激活感觉皮层也同样有效，我们还将线圈插入到桶状皮层中（图5C，左侧），并再次检查了由磁刺激诱发的触须运动（图5，C和D）。10赫兹和100赫兹的刺激都仅导致触须回缩（图5C，右侧面板；5个中有5个），这与电刺激引发的运动一致。总之，这些结果有力地证明了新型微线圈能够在体内有效地驱动神经回路。此外，这里磁刺激所引发的反应与先前电刺激所描述的反应高度相似，这表明每种刺激都引发了相似的神经活动模式。
体内激活的阈值为7至10毫安，因此大约是体外激活阈值的五分之一。同样，我们没有系统地评估阈值与插入深度的关系，也没有试图确定是否更浅的深度（例如，将线圈尖端置于顶端树突上方的深度）会更有效。因此，阈值可能还会进一步降低。一般来说，制作的线圈的阈值略低于由弯线制成的线圈的阈值。然而，我们不太愿意在此得出过于肯定的结论，因为不同的线圈设计可能会使其中一种设计偏向于放置在神经元更敏感的部位。
低功率重复微磁刺激
先前的电刺激实验已经证明，即使每个刺激本身是亚阈值的，通过重复传递低幅度刺激也能引发神经元反应。例如，海马神经元可以被以1至2赫兹频率传递的场强为0.14伏/米的刺激所激活，尽管据认为单个脉冲激活浦肯野神经元和星状神经元的阈值接近10伏/米。磁刺激若有类似的发现将很有吸引力，因为这可能有助于进一步降低与这些设备相关的功耗。我们测试了在幅度固定为我们能够提供的最低水平（11.2毫伏，对应于0.75毫安的刺激电流）时，以1至100赫兹的频率进行重复刺激是否能引发触须运动。对于1赫兹的频率，每秒传递一个脉冲，总持续时间为10秒，而对于所有其他频率（10、50和100赫兹），每秒传递三个脉冲，持续时间为5秒（不同刺激序列的时间安排如图6A所示）。低幅度刺激引发了微小的触须运动（图6B），与早期实验类似，对于更高的刺激频率，运动方向会反转（图6，B和C）（8个中有8个）。我们通过对刺激期间触须偏转的幅度求平均值，并将其与刺激前后的偏转进行比较来量化运动水平[图6C，对刺激前2秒和刺激后10秒求平均值（见材料与方法）；n = 5；t检验，P = 0.0001]。结果显示这些刺激引发了微小但在统计学上显著的运动。尽管对于这种方法要实际有用还需要克服这些反应所伴随的长潜伏期问题，但结果仍然令人鼓舞，因为它们表明在非常低的功率水平下也可能实现激活。
图6 持续刺激在较低功率水平下引发触须运动
（A）重复刺激波形的示意图。每个“脉冲”是一个单一的3千赫兹正弦波。
（B）在11.2毫伏（0.75毫安）功率水平下，对重复刺激的平均触须运动反应。
（C）每种波形的平均触须运动（向上表示前伸；向下表示回缩）。
三、讨论
在这里，我们展示了一种新型微线圈，其尺寸与通常植入大脑皮层的电极相当，它能够在体外有效地激活神经元，并且也能在体内驱动神经回路。通过对细导线进行一次急剧弯曲，能够产生一个强大的局部电场梯度，该梯度远远超过了先前对激活阈值的估计。这种新设计使得植入物的横截面轮廓从原始电感器的500微米×500微米减小到了这里的50微米×100微米；更小的尺寸使得线圈能够安全地插入大脑皮层，而不像先前的微线圈设计那样只能将放置位置限制在非皮层区域。
生理测试证实了模型预测，并且不仅表明微线圈刺激可以激活大脑皮层神经元，还表明可以有选择地靶向特定类型的神经元。例如，体外实验表明，当感应电场沿着目标锥体神经元（PN）的长度方向排列时，会产生强烈的激活，但当线圈旋转90°时，例如，使得电场及其梯度与目标神经元正交时，则几乎没有或完全没有激活。与电刺激类似，即使在高幅度下进行长时间刺激，对于这种取向也是无效的。这表明，当将线圈插入大脑皮层进行体内实验时，水平取向的过路轴突受到的激活力极小，很可能不会产生反应，而局部的锥体神经元则被强烈激活。研究表明，电刺激偶然激活过路轴突会导致对给定刺激的反应远远超出电极周围的局部区域。激活的扩散是不理想的，因为它降低了刺激的有效性；例如，针对视觉皮层的假体所能达到的潜在视敏度，以及脑机接口向初级躯体感觉皮层提供精确反馈信号的能力都会降低。因此，基于线圈的磁刺激能够激活垂直取向的锥体神经元而不同时激活水平取向的过路轴突，这可能有助于更好地将激活限制在仅局部神经元上，并可能带来更有效的刺激。还需要进一步测试，以确定其他非锥体的垂直取向神经元或轴突是否也会被线圈激活，并确定每种的相对敏感性。尽管在确定激活的潜在机制方面存在不确定性，但对磁刺激和电刺激的行为反应的高度相似性表明，这两种方式下的潜在神经元反应可能是相似的。
与电刺激的使用类似，微线圈激活的神经元数量可以通过改变刺激幅度以及线圈本身的设计来改变。在低刺激幅度下，激活可以局限于线圈尖端约60微米范围内的那些神经元。这相当于体积约为0.0001立方毫米；根据先前对小鼠初级运动皮层（M1）中神经元密度的估计，1毫安的刺激会激活8个细胞。作为比较，估计50毫安的刺激激活的组织体积为0.009立方毫米，会激活676个细胞。
我们还通过在给定刺激强度下，系统地将线圈从目标细胞移开，来估计体外实验中的激活体积。这些实验得出的定性结果与从模型中估计的值相似；例如，50毫安的刺激在距离细胞约150微米的范围内仍然有效——这与模型预测的大致相同。钙成像实验进一步证实了这一估计；例如，对于52毫安的刺激，激活区域从线圈延伸约160微米。考虑到植入物周围可能普遍存在神经胶质瘢痕 ，以及细胞可能从植入物处迁移，这种扩大激活区域的能力对于长期植入物来说将是很重要的。随着时间的推移，线圈感应电场的特性可能会更加稳定，因为磁场可以轻易穿过植入物周围可能存在的高阻抗神经胶质包封层，而包封层会显著改变电极产生的电场的强度和空间分布。此外，线圈不存在金属与大脑的直接接触，这消除了许多电极-大脑界面的问题，例如，植入后电极阻抗的可变性。
这项研究的结果表明，功耗（定义为电流平方与阻抗的乘积）不会妨碍在急性或慢性研究中使用微线圈。磁刺激相关的电流水平通常高于电刺激的电流水平，而线圈的阻抗通常低几个数量级（例如，20欧姆对比1兆欧姆）。因此，大致来说，线圈所需的电流可以比电极的电流大两到三个数量级，但仍然能产生相似的功耗水平。当然，还有许多其他因素会影响功耗，更高的电流水平可能需要专门的电源，但这一估计表明，更高的电流水平不一定会导致过高的功耗。
新的线圈设计使得阈值大幅降低（功率水平总结在图S1中）。例如，脑切片中L5锥体神经元单脉冲激活的阈值为40至45毫安，比使用原始线圈在类似实验中获得的阈值低近16倍。这意味着功率从约2瓦降低到了约10毫瓦。使用新线圈进行体内激活的阈值甚至更低（7至10毫安），使估计的功率水平降至0.4毫瓦，比先前使用原始微线圈进行体内实验所需的功率降低了两个数量级以上。几乎可以肯定的是，体内阈值大幅降低的很大一部分原因是新设计能够直接插入大脑皮层，而先前的设计将线圈的放置限制在大脑皮层表面。
尽管这里的估计仍然是初步的，但令人鼓舞的是，它们与现有的临床设备的水平相比具有优势；例如，深部脑刺激植入物的功率水平范围为2至24.5毫瓦（图S1）。新型微线圈的功率水平与体内对运动皮层进行电刺激的功率水平相比也具有优势。然而，基于线圈的功率水平仍然超过对感觉皮层进行电刺激的功率水平。这种差异的一部分可能反映了感觉皮层与运动皮层相比具有更高的敏感性，因此对视觉皮层神经元进行进一步测试可能会导致功率进一步降低。无论如何，自从引入原始线圈以来，微线圈刺激相关的功率水平已经下降了几个数量级，并且鉴于这项技术的快速发展，功率水平很可能会进一步降低。
除了降低功率水平之外，微线圈的尺寸和选择性也很可能会继续得到进一步优化。即使是相对简单的改进，例如在同一位置并入多根急剧弯曲的导线，也很可能会增强刺激的强度。其他设计改进，例如在同一探针柄的不同深度使用多根导线，可能允许有选择地靶向不同深度的神经元；例如，L2/3层和L5层的那些锥体神经元可以各自独立地被激活。这种方法可能有助于用假体更好地重现生理信号模式。还有可能的是，这里使用的相对简单的弯曲可以得到改进，以进一步优化刺激的功效和取向选择性，也就是说，尖端的双弯曲（形成一个“W”形状）可能被证明比这里使用的简单弯曲更具选择性。使用能够增强磁场强度的材料（例如铁氧体、坡莫合金和透磁合金）也可能有助于进一步提高刺激的功效，同时相应地降低功率水平。最后，使用纳米级导线可能有助于在不显著降低功效的情况下进一步减小线圈尺寸。选择性靶向、更高的可靠性以及与现有设备相当甚至可能更低的功率水平相结合，使得植入微线圈有可能为现有的基于电极的大脑皮层刺激方法提供一种极具吸引力的替代方案。
四、材料与方法
01. 微线圈建模
使用 MATLAB 编写的定制软件计算电流通过微线圈时产生的感应电场（E 场）的空间梯度。
根据法拉第定律，E 场
，与时变磁场的关系为
由于磁场，
，可以通过取磁矢势旋度得到，
（即，
）电场方程可以表示为
假设线圈上没有电荷，且线圈中的电流分布均匀（即准静态条件），∇V 等于 0，则公式 2 变为
磁矢势根据线圈几何形状计算如下
其中 μ0 为磁导率常数，N 为匝数，i 为通过线圈的电流，R 为线圈段与计算电场的目标段之间的矢量，dl 为线圈的短段。
由于每个皮质柱内 PN 的主轴大致平行于 x 轴（参见图 1），因此可以通过沿线圈环路长度进行数值积分来计算皮质柱上的电场。
其中 x 维度对应于 PN 的长轴。
整合
关于直线的 x 分量，给出以下方程
在上式中，线圈元件位于 (x0,y0,z0) 处，电场在 (x,y,z) 处计算。x1 和 x2 表示矩形线圈角在 x 轴上的位置。空间梯度
，是通过对解析解求导来计算的
根据公式6。输入到线圈的电流(i)是一个3千赫兹正弦波形的半周期，振幅为1毫安。
我们考虑并建模了两种类型的微线圈。第一种类型是一个方形环（每边500微米），它基本上是从先前研究中使用的电感器上截取下来的单匝环（图1A）。第二种类型是一个不对称的梯形环，长1000微米，宽100微米；在尖端宽度逐渐缩小到50微米（图1B）。这种梯形环线圈与后续生理实验中使用的硅微探针线圈非常相似。
02. 微线圈的制作与测试
微线圈的制作过程基于硅加工技术。首先，将一块50微米厚、直径4英寸的硅片用粘合剂粘结到一块支撑片上。随后，使用等离子体增强化学气相沉积（PECVD）法沉积一层100到200纳米厚的二氧化硅层。然后，利用电子束（e-beam）辅助物理气相沉积法溅射一层2微米厚的铜层，先沉积一层10纳米厚的钛层以增强粘附性。接下来，旋涂光刻胶并烘烤，将其用作下一个蚀刻步骤的掩模。通过相移光掩模对光刻胶进行紫外光曝光来构图。之后，使用溶液对铜进行湿法蚀刻。在丙酮中去除光刻胶，然后使用PECVD法在上面沉积300纳米的绝缘二氧化硅层。对电接触垫区域进行遮挡，以确保其表面没有顶部绝缘层。在这一步之后，旋涂光刻胶并构图，将其用作硅蚀刻的掩模。使用深反应离子蚀刻法蚀刻穿透50微米厚的硅衬底。然后将得到的微线圈结构（图3A）在丙酮中从支撑片上释放出来并干燥。我们还使用了一根超细铜线制作了一个微线圈[裸线直径50微米（45号美国线规），聚氨酯底漆，聚酰胺外涂层，带绝缘层后为60微米]（图3B）。
将制作好的线圈与铜线引线（34号美国线规，聚氨酯内涂层和尼龙外涂层）组装在一起。使用银导电环氧树脂将微线圈的电触点与铜线引线连接起来。用瞬间粘合剂将组装好的线圈安装在定制的塑料支架上，并将铜线引线的末端连接到一个BNC（卡口式尼尔 – 康塞曼）连接器的信号和接地引线上。将定制的组件固定在立体定位框架（900型）的显微操作器上，以便在小鼠大脑皮层上精确定位。
在每次实验前后都要对每个微线圈组件进行测试，以确保没有电流从线圈泄漏到小鼠大脑皮层中。将线圈浸入生理溶液（0.9%的氯化钠溶液）中，在每次体内动物实验前后测量线圈的一个端子与浸入生理溶液中的电极之间的阻抗。阻抗高于200兆欧姆被认为是绝缘良好的指示。高阻抗确保了直接电流不会对观察到的小鼠行为背后的任何诱发神经活动产生影响。
03. 微磁刺激驱动
函数发生器的输出连接到一个1000瓦的音频放大器，该放大器增益为5.6伏/伏，带宽为70千赫兹。音频放大器由电池供电。用示波器监测放大器的输出。一个刺激脉冲由一个单一的完整周期3千赫兹正弦波形组成。函数发生器输出的正弦波振幅范围为0到200毫伏。放大器输出的正弦波为0到1.12伏。单串刺激（图5A）分别由5个或10个脉冲组成，以10赫兹和100赫兹的频率传递。以每秒1个脉冲的频率进行重复刺激，总持续时间为10秒。其他重复刺激包括以10赫兹、50赫兹或100赫兹的频率，每秒3个脉冲，总持续时间为5秒。
04. 体外脑切片实验
使用从17至30日龄的小鼠（C57BL/6J）制备的脑切片进行电生理记录。动物的饲养和使用遵循所有联邦和机构指南、波士顿退伍军人事务部（VA）医疗系统的机构动物护理和使用委员会以及马萨诸塞总医院研究动物护理小组委员会的规定。用异氟烷将小鼠深度麻醉后断头。小鼠死亡后立即取出大脑，并在冰上，于含有1.25毫摩尔/升磷酸二氢钠、2.5毫摩尔/升氯化钾、25毫摩尔/升碳酸氢钠、1毫摩尔/升氯化镁、25毫摩尔/升葡萄糖和225毫摩尔/升蔗糖的0°C至5°C充氧溶液中，分离出包含触须初级运动皮层（M1）（前囟前方0.5至1毫米处）的大脑部分，该溶液用95%的氧气和5%的二氧化碳平衡（pH值7.4）。这种低钠离子且不含钙离子的冷溶液提高了组织的存活力。在相同的培养基中，使用振动刀片切片机制备300至400微米厚的冠状切片，并将其在室温下，于含有125毫摩尔/升氯化钠、1.25毫摩尔/升磷酸二氢钠、2.5毫摩尔/升氯化钾、25毫摩尔/升碳酸氢钠、1毫摩尔/升氯化镁、2毫摩尔/升氯化钙和25毫摩尔/升葡萄糖的人工脑脊液（aCSF）溶液中孵育，该溶液用95%的氧气和5%的二氧化碳平衡（pH值7.4）。恢复2小时后，将含有M1的切片转移并尾侧朝下，固定到一个带有塑料切片固定器的塑料记录室中。记录室保持在30°±2°C，并持续用充氧的aCSF溶液灌流（3.3毫升/分钟）。
在视觉控制下靶向触须M1第5层（L5）的锥体神经元（PNs）。用一个填充有灌流液的膜片电极（4至8兆欧姆）记录放电情况，将其放置在目标锥体神经元的表面[松散密封（15至20兆欧姆）的细胞贴附模式]。膜片钳放大器在电压钳模式下操作，保持电位（即指令电位）为0毫伏或放大器电流Iamp为0皮安的类似水平。在这种模式下记录胞体动作电位被认为是捕获电容充电电流（Cm·dV/dt），所以波形反映的是电压随时间的导数，而不是电压与时间的关系，但仍然能准确指示胞体放电（24, 50–54）。使用电压钳模式会捕获动作电位背后的电流，因此去极化由向下的偏转（内向电流）反映，随后是向上的超极化电流。两根涂有氯化银的导线用作地线，放置在记录室的相对边缘，每根导线距离目标细胞约15毫米。将微线圈组件固定在显微操作器上，使线圈平面与切片的顶面垂直或平行（比较图3E）。将线圈组件下降到浴液中，直到线圈位于目标锥体神经元上方50微米处。
在一些实验中，向灌注浴液中添加10微摩尔的6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX）（或10微摩尔的2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔啉（NBQX））和/或50微摩尔的d-2-氨基-5-磷酸戊酸（d-AP5）或d-2-氨基-5-磷酸戊酸（d-APV），分别阻断α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）/红藻氨酸盐和N-甲基-d-天冬氨酸（NMDA）通道。使用γ-氨基丁酸A型（GABAA）受体拮抗剂（+）-荷包牡丹碱（10微摩尔）阻断抑制性突触传递。使用河豚毒素（TTX）（1微摩尔）阻断动作电位。药物每天从浓缩储备溶液中配制；在使用前不久，加入去离子水将储备溶液稀释至适当浓度。
05. 钙荧光成像与分析
使用从17至30日龄的转基因小鼠（Thy1-GCaMP6f）制备的脑切片进行钙荧光成像。动物的饲养和使用遵循所有联邦和机构指南、波士顿退伍军人事务部（VA）医疗系统的机构动物护理和使用委员会以及马萨诸塞总医院研究动物护理小组委员会的规定。脑切片使用上述相同方法制备和保存，然后在暗室中，于室温下在aCSF溶液中孵育。恢复2小时后，将含有初级视觉皮层（V1）的切片转移并尾侧朝下，固定到一个带有塑料切片固定器的塑料记录室中。
使用显微镜，通过一个20倍、数值孔径为0.5的物镜进行成像。激发光源耦合到显微镜的落射荧光端口。用一个电荷耦合器件相机捕获钙荧光变化。实际成像区域为267微米×200微米。
首先通过一个放置在第4层（L4）或第5层（L5）的1兆欧姆铂铱（Pt-Ir）微电极（用于生命科学的Microprobes公司产品），以200微秒、0至30微安的阴极第一双相电流脉冲（即以100赫兹的重复率传递100个脉冲）进行电刺激，诱发V1区L5锥体神经元的钙荧光瞬变（图4，A和B）。每个电刺激进行三到五次，每次试验的钙瞬变取平均值。
然后将微线圈放置在L4或L5层，通过单个周期的正弦波形磁刺激诱发钙荧光瞬变；输入电流幅度范围为0至74毫安。通常以100赫兹的重复率传递100个脉冲。微线圈由直径25微米的铂铱线制成，带有4微米厚的绝缘层。磁刺激重复三到五次，对钙瞬变取平均值以确定反应。
使用图像捕获软件记录图像，并使用图像分析软件进行处理。使用先前描述的方法（32, 33）提取单个锥体神经元的钙荧光瞬变。简而言之，定义单个锥体神经元的轮廓以创建感兴趣区域（ROI），并通过对每个ROI内的像素求平均值来计算细胞钙瞬变。还提取每个神经元周围20微米环形区域内神经纤维网的钙瞬变，以校正神经纤维网的干扰（33）。使用以下公式估计来自神经元（细胞体）的真实荧光瞬变：Fcell_true(t) = Fcell_apparent(t) − r × Fsurrounding_neuropil(t)，其中t是时间，r是干扰比率[在本研究中，对于20倍物镜，选择r = 0.7（32, 33）]。在校正神经纤维网干扰后，单个神经元的钙荧光瞬变计算为ΔF/F (%) = (F − F0)/F0，其中F0是通过在刺激开始前2秒内求平均值计算的基线荧光水平。
06. 体内动物实验
所有实验均使用2至4个月大的小鼠（C57BL/6J）进行。动物的饲养和使用遵循所有联邦和机构指南、波士顿退伍军人事务部（VA）医疗系统的机构动物护理和使用委员会以及马萨诸塞总医院研究动物护理小组委员会的规定。在手术开始前，用盐酸氯胺酮（100毫克/千克，腹腔注射）和甲苯噻嗪（10毫克/千克，腹腔注射）的混合剂将小鼠深度麻醉。每30分钟补充额外的氯胺酮（初始剂量的1/10）以维持麻醉平面。
将麻醉的小鼠置于立体定位框架中进行颅骨切开术以及所有后续测试。框架底部的加热毯用于将体温维持在37°C（通过直肠监测）。将利多卡因（2毫克/千克，皮下注射）注射到头皮中，进行中线切口，然后去除覆盖在运动皮层和/或感觉皮层上的部分颅骨和硬脑膜。将微线圈植入触须运动皮层（前囟前方0.5至1毫米处，外侧0.2毫米处）或触须感觉皮层（前囟后方1至2毫米处，外侧2毫米处）。除非另有说明，线圈插入深度为500微米。
07. 麻醉小鼠触须运动的检测
我们使用高清网络摄像头拍摄因磁刺激而产生的触须运动，以便能够准确地对运动进行量化。所有视频文件均以30帧/秒的速率捕获，足以检测相对缓慢的触须运动。触须运动的视频记录在刺激开始前2秒开始，在刺激结束后12秒结束。刺激开始前2秒内以及刺激终止后10至12秒内的2秒时间段内的触须运动，用于计算基线（对照）运动。刺激通常会诱发有节奏的触须运动，这种运动在刺激终止后会持续3至5秒。使用运动跟踪和分析软件从原始视频文件生成触须轨迹。对每个刺激参数进行三到五次重复并取平均值。
08. 数据分析
在所有统计分析中，使用非配对t检验评估不同刺激条件下平均值之间的差异是否显著。与P值<0.05相关的差异被视为具有统计学意义。方差以±标准差或±标准误报告。
公司地址：广东省东莞市樟木头镇塑金国际1号楼810
