姜黄素在体内的抗血管生成作用
据报道，姜黄素在体外和体内都有抗血管生成的作用。因此，我们使用针对内皮细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和CD34抗原(CD34)的抗体，分析了小鼠使用姜黄素或单独使用载体处理B16异种移植后的血管数量和大小。如图3所示，姜黄素显著减少了单位面积的α-SMA阳性血管数量(图3A和B)以及单位血管的α-SMA和CD34阳性细胞数量(图3A-D)，这表明系统给药的多酚对B16异种移植具有抗血管生成活性。
姜黄素通过促进氧化应激和脂质应激，降低不同癌细胞株的活力并诱导肿瘤细胞凋亡
姜黄素的抗代谢作用有望转化为细胞生长的减少。因此，我们分析了多酚处理后肿瘤细胞的存活率。我们观察到，用10µM姜黄素处理24小时后，B16、CT26、L1210和4T1细胞活力显著降低，分别降低了37%、28%、20%和36%(图4A)。
姜黄素处理B16、CT26、L1210和4T1细胞24小时后，细胞凋亡率增加，分别比对照组细胞增加了83%、73%、146%和316%(图4B)。
姜黄素处理过的B16、CT26和L1210细胞中的ROS分别比对照组高出207%、59%和78%(图4C)，细胞凋亡可能是姜黄素诱导ROS的结果。同样，姜黄素处理的细胞中，脂质过氧化标志物丙二醛(MDA)水平比对照组细胞增加(B16、CT26、L1210和4T1细胞分别增加了37%、134、109和60%图4D)。
姜黄素激活AMPK，诱导自噬
5′-AMP激活的蛋白激酶(AMPK)是细胞中的一个主要能量检查点，我们预测姜黄素处理的细胞中ATP/AMP比率的改变会激活AMPK。但我们观察到姜黄素处理的B16细胞与对照组相比，AMPK磷酸化有很强的诱导作用，使用抗磷酸AMPK(pAMPK-Thr172)抗体进行的Western印迹显示了这一点(180%；图5A)。
为了重建足够的ATP水平，pAMPK诱导自噬。我们测量了作为自噬标志物的微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)和溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)。与对照组相比，姜黄素处理的B16细胞中这两种蛋白都有明显诱导作用(LAMP1和LC3B的诱导作用分别为190%和150%，图5B和C)。
姜黄素改变糖酵解酶的活性
通过氧化磷酸化减少的ATP合成可以通过增强糖酵解活性来补偿，虽然效率较低，但也能产生ATP。对己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脱氢酶(LDH)等关键糖酵解酶活性和乳酸水平的分析表明，CT26、L1210和4T1细胞的情况并非如此，后者的酶活性也降低或保持不变(表)。结果表明所有四种酶活性的诱导以及乳酸生成表明对ATP合酶抑制的部分补偿作用(表)。
讨论
姜黄素的抗肿瘤活性在各种模型中得到了很好的证实，主要与姜黄素对肿瘤炎症的作用有关，这种作用既作用于微环境，也作用于癌细胞本身。这些抗炎作用的主要介质是NFκB，它是炎症和细胞凋亡的主要调节因子。许多其他信号通路被描述为受姜黄素的影响，但尚不清楚这些通路在多大程度上是姜黄素的主要分子靶点。
越来越多的证据表明姜黄素的抗糖尿病作用及其对细胞代谢的影响激发了我们对其对肿瘤代谢的潜在活性的兴趣。最近的研究表明，对能量高度活跃的肿瘤细胞的营养供应的限制可以极大地改变肿瘤代谢，从而改变肿瘤细胞的活力和生长。最近有人假设姜黄素可以作为卡路里限制的模拟物。
因此，我们研究了姜黄素对肿瘤细胞代谢的影响，重点是ATP合成，因为多酚已被证明通过结合复合物F1片段的特定位点来抑制来自大肠杆菌的ATP合成酶，从而显著增加ATP水解的催化停留时间。在正常大鼠肝细胞中，姜黄素对线粒体ATP合成酶的影响已经有报道，姜黄素作为质子载体解偶联剂，从而激活该复合物的fof1-ATP酶活性，导致ATP生物合成减少。因此，AMP水平的增加被认为是激活主能量传感器AMPK的原因。在这里，我们发现姜黄素能持续减少小鼠肿瘤细胞中的ATP合成。这种活性与诱导细胞凋亡和AMPK介导的自噬有关，从而降低了肿瘤细胞的存活率。诱导细胞凋亡可能与姜黄素介导的ROS生成刺激有关，ROS生成刺激已被证明会导致前列腺癌的内质网应激。
鉴于ATP在细胞代谢中的核心作用，姜黄素对ATP合成的影响可能是其最重要的作用。减少ATP合成似乎对姜黄素作为热量限制模拟物的活性也很重要。禁食或短期饥饿会产生强烈的反沃伯格效应，主要作用于糖酵解途径中的酶，这一点在基因和蛋白质表达水平上都有所体现，并对整体活性产生影响。同样，姜黄素降低了不同肿瘤细胞中关键糖酵解酶的活性，只有小鼠黑色素瘤细胞系B16例外，因为该细胞系的线粒体呼吸(耗氧量和ATP合成)基本上很低(见图1)。我们认为，姜黄素处理后ATP合成进一步减少会损害细胞活力，B16细胞试图通过提高糖酵解酶的活性来补偿多酚的影响。然而，姜黄素在诱导AMPK磷酸化和自噬随之增加方面模拟了禁食对B16细胞的影响。
姜黄素造成的能量损伤在体内也能观察到，并最终转化为肿瘤生长的减少。我们选择了一种免疫缺陷小鼠模型，以便从免疫反应介导的最终效应中分辨出多酚的直接抗肿瘤效应。有趣的是，姜黄素在体内还显示出抗血管生成的作用，这可能也是抗肿瘤活性的原因之一。
姜黄素的其他几种抗肿瘤活性已被证实。在这里，我们关注的是其抗代谢作用。ROS介导的DNA聚合酶γ的耗损很可能是ATP合酶活性降低的结果。姜黄素对细胞微管组织的影响最近有报道，但似乎与它的代谢活动无关。姜黄素被认为可以增加化疗的活性并降低其毒性，其作用可能与其对炎症的主要调节因子NFκB的抑制活性有关。这种活性是由姜黄素抑制IkKβ介导的。而IkKβ的合成抑制剂SC-514对ATP的合成没有影响，这表明姜黄素的两种活性是独立的。目前还无法确定姜黄素的抗代谢和抗炎作用在多大程度上决定了体内肿瘤生长的减少。事实上，姜黄素抑制的肿瘤进展和血管生成与NFκB介导的炎症以及葡萄糖代谢有关。使用同样具有抗肿瘤活性的抗糖尿病药物二甲双胍进行代谢干预，却发现了部分促进血管生成活性的矛盾现象。姜黄素和二甲双胍都通过AMPK途径发挥作用，但姜黄素还能直接抑制ATP合成酶，可能会以更直接的方式影响内皮细胞的活力。未来的研究必须解决抑制ATP合成对血管生成的作用问题。虽然我们在这项研究中使用的是鼠癌细胞，但人类癌细胞很有可能至少具有相同的抗代谢作用。
尽管对姜黄素的研究已有十年之久，但其作用机制的一些关键方面仍然模糊不清。尤其是姜黄素的生物利用率低，在血液中降解和消除速度快，因此目前还不清楚在体外观察到的姜黄素效应如何转化为体内效应。然而，通过小鼠饮食给药姜黄素对体内肿瘤细胞有显著效果，这需要吸收化合物本身或其降解产物或肠道代谢物。在这里，我们将姜黄素直接注入动物的尾静脉，以避免与生物利用度相关的问题。30毫克/千克体重相当于体重70千克的成人2.1克。目前还不清楚姜黄素溶液在人体中的静脉注射情况，但如果能找到合适的载体，注射类似剂量的姜黄素也是可能的。不过，在化学预防方面的最终应用显然需要口服给药。我们使用了B16小鼠黑色素瘤细胞，这是一种成熟的黑色素瘤研究模型。我们计划在未来的实验中使用患者衍生的异种移植物来解决肿瘤在患者之间和患者内部的异质性问题。
姜黄素被描述为泛检测干扰化合物(PAIN)，其生物活性一直受到质疑。在本研究中，我们展示了经过严格控制的生物检测数据，其中姜黄素对ATP合酶具有明显的抑制活性，可改变癌细胞的新陈代谢，从而导致生长减慢、细胞凋亡和自噬。我们采用的所有检测方法都不会因化合物不受控制的自发荧光而产生偏差。尽管有许多设计不合理的研究报告了有关姜黄素的不可靠数据，但这种化合物确实具有抗癌活性，正如本文所述。总之，抑制ATP合成似乎是膳食多酚姜黄素的另一个主要活性，它与已知的NFκB依赖性抗炎活性一起控制着肿瘤细胞的活力。姜黄素显示的活性与短期饥饿观察到的活性部分重叠，因此可被视为真正的卡路里限制或禁食模拟物。抗代谢和抗炎活性的结合使姜黄素成为预防癌症、代谢综合症和其他老年性疾病的有效药物，最终有助于延长寿命。
