在这篇文章中，研究者们探讨了“Shoutai Pill”（STW）在治疗原发性卵巢功能不全（POI）中的作用，发现其通过调节EGFR/PI3K/AKT信号通路，协同抑制内生殖器官的细胞凋亡，从而改善卵巢和子宫的功能。研究表明，STW能够恢复激素平衡、促进卵泡发育和子宫内膜修复，为POI的治疗提供了新的分子机制和潜在的治疗策略。
1. STW的UHPLC-Q-Exactive-MS/MS分析
研究发现STW含有多种化合物，共鉴定出253种成分，其中150种在负离子模式下检出，117种在正离子模式下检出。包括咖啡酸、蔗糖和绿原酸在内的14种化合物可在正负两种电离模式下同时检出。结果如图1所示。
2. 网络药理学预测STW核心靶点与通路
网络药理学通过筛选出270个STW与POI的共同作用靶点，构建并可视化出蛋白互作网络（图2A），进而基于拓扑分析确定了46个涉及激素受体与细胞凋亡的核心靶点（图2B）；富集分析结果显示，这些核心靶点显著富集于PI3K-AKT、HIF-1等信号通路以及激素应答等生物过程中（图2C, D），而成分-靶点-通路网络则进一步揭示木犀草素、槲皮素等45种活性成分可能通过调控上述核心靶点与通路来发挥治疗作用（图2E）。图2的实验结果表明STW可能通过多成分、多靶点、多通路的方式干预POI。
3. STW改善POI小鼠的躯体及生理症状
STW的治疗方案设计如图3A所示；如图3B所示，尽管STW-H组小鼠体重在30天后呈现增长趋势，但各组间体重无统计学差异；图3C和3D显示，与模型组相比，STW各干预组均能显著提升小鼠的抓力强度与活动比值；图3E-H表明，STW治疗有效降低了表征唇色紫暗的B值以及表征舌色变白的RGB值；图3I和3J的热成像结果进一步证实，STW能显著降低模型小鼠异常的背部温度。综上所述，STW能有效改善POI模型小鼠的体力活动下降、唇舌颜色异常及烘热等核心症状。
4. STW恢复血清激素水平及动情周期
STW治疗显著逆转了POI小鼠的内分泌失衡，具体表现为其能剂量依赖性地提升血清E₂水平，并显著降低异常升高的FSH与LH浓度（图4A-C）；通过对阴道脱落细胞形态的观察（图4D, E），研究发现STW有效改善了动情周期紊乱，显著提高了拥有正常周期的小鼠比例（图4F），并明显缩短了平均动情周期天数（图4G）。实验结果充分证明STW能够通过调节“下丘脑-垂体-卵巢”轴相关激素水平，从而恢复POI小鼠的正常动情周期。
5. STW 维持卵巢结构并刺激卵泡生长
与正常对照组（NC）相比，模型对照组（MC）小鼠卵巢出现萎缩、卵泡形态异常及颗粒细胞排列紊乱等结构损伤（图5 A）。定量分析显示，MC组卵巢指数显著降低，同时闭锁卵泡数量显著增加，而原始卵泡与生长卵泡数量明显减少（图5 B–G）。与MC组相比，STW中、高剂量组（STW-M、STW-H）和阳性对照组（PG）均能有效恢复卵巢大小，其中STW-M和STW-H组的卵巢指数显著提高（图5 B）。在卵泡发育方面，各STW组均显著降低了闭锁卵泡数量，STW-H组较MC组减少达54%（图5 C–G）；STW-H组和PG组的原始卵泡数量显著增加（图5 C–G）；STW-M、STW-H及PG组的窦前卵泡数量也显著提升，其中STW-H组效应量较大（Cohen’s d = 1.47）（图5 C–G）；此外，STW-H组的窦状卵泡数量亦显著增多（图5 C–G）。综上所述，STW能有效维持卵巢结构并促进卵泡发育，从而改善卵巢功能。
- STW修复子宫形态并提升子宫内膜容受性
HE染色子宫切片显示，NC组子宫内膜结构完整透明，富含大量腺体（图6A）。与NC组相比，MC组子宫指数显著降低、子宫内膜变薄、腺体数量减少。PG组、STW-L组与STW-H组的子宫指数较MC组显著提升。PG组与STW各干预组的子宫内膜厚度均明显大于MC组，其中STW-H组效应值尤为突出（Cohen’s d=2.53，强效应值）。与此同时，仅PG组与STW-H组呈现腺体数量显著增加（图6B-D）。这些发现证实STW能有效增强子宫内膜容受性。
7. DIA蛋白质组学鉴定出STW调控的差异表达蛋白及通路
DIA蛋白质组学分析显示，与模型组相比，STW-H组共鉴定出245个差异表达蛋白（图7B），其表达模式在组内呈现良好平行性（图7A）；这些蛋白与卵巢参考基因及凋亡相关靶标密切关联（图7C, D），并主要富集于细胞代谢、催化活性等生物过程（图7E, F），其中ECM-受体相互作用、ErbB以及PI3K-AKT信号通路是改变最显著的途径（图7G）。图7结果表明STW通过调控关键蛋白与信号通路，尤其是EGFR/PI3K-AKT通路，可能经线粒体凋亡途径改善POI卵巢功能。
8. 分子对接揭示关键化合物-靶点相互作用机制
为进一步阐明STW治疗POI的分子机制，作者通过分子对接分析评估关键活性成分与核心靶点蛋白的相互作用。根据成分-靶点-通路网络中DC值排名前5的成分（表S4），包括木犀草素、山奈酚、松柏醛、桑色素和槲皮素进行对接分析。结果显示共获得25个结合自由能≤−5.1 kcal/mol的稳定结合对（图8A）。其中EGFR与木犀草素和槲皮素的结合能力最强（结合能−8.9 kcal/mol）；PIK3R1与山奈酚和槲皮素的结合能力最佳（结合能−6.9 kcal/mol）；AKT1与桑色素的结合能力最强（结合能−9.8 kcal/mol）；BCL2和BAX BH3均与木犀草素呈现强结合能力（结合能−7.1 kcal/mol）。三维对接可视化结果如图8C-G所示。这些发现表明木犀草素、山奈酚、松柏醛、桑色素和槲皮素可能是STW的主要活性成分，其可能通过分子水平调控EGFR/PI3K/AKT通路中的凋亡蛋白发挥抗POI作用。分子对接结果表明，木犀草素、山奈酚、松柏醛、桑色素和槲皮素这五种STW核心成分，能通过与EGFR/PI3K/AKT通路中的关键凋亡蛋白高强度结合，从而发挥治疗POI的作用。
9. STW减少卵巢与子宫细胞凋亡
接下来，作者对卵巢和子宫进行TUNEL标记检测（图9A–F），发现MC组卵巢与子宫的凋亡细胞数较NC组显著增加；而STW干预逆转了该现象，两器官中凋亡阳性细胞数较MC组均明显减少（图9B–G）。随后通过免疫组化检测凋亡相关蛋白（图9C–H），与NC组相比，MC组卵巢和子宫组织中BCL2水平下调（图9D–I），BAX表达水平则升高（图9E–J）。STW-H处理可显著抑制两器官中BAX的表达（图9E–J），而STW-M和STW-H均能显著提升BCL2水平（图9D–I）。上述结果表明STW能够抑制模型小鼠内生殖器官的细胞凋亡。
10. STW 激活内生殖器官中的 EGFR/PI3K/AKT 信号通路
研究采用 IHC (图 10A–I) 和 WB (图 10E) 评估了相关蛋白的表达水平。与 NC 组相比，MC 组卵巢中 EGFR、PI3K p85 和 AKT 的表达量显著降低 (图 10B–D, F–H)，其子宫中这些蛋白的水平也较低(图 10J–L)。另一方面，与 MC 组相比，STW 干预导致卵巢和子宫中 EGFR、PI3K p85和AKT的量增加(图 10B–D, J–L)。具体而言，所有STW给药组的卵巢EGFR和PI3K p85表达均显著升高，且STW-H 组的AKT水平明显更高。在子宫中，所有STW组的 EGFR表达均明显增强；STW-L和 STW-H组的PI3K p85水平升高；STW-M和 STW-H组的AKT 表达显著增加。根据WB分析，STW-H组卵巢中EGFR、PI3K p85和AKT的表达明显高于MC组(图 10F–H)。这些发现与之前的生物信息学和分子对接研究结果一致，表明STW通过 EGFR/PI3K/AKT通路减轻POI内生殖器官的细胞凋亡。
结论
Shoutai Pill（STW）通过调节EGFR/PI3K/AKT信号通路，显著抑制了初级卵巢功能不全（POI）小鼠的内生殖器官细胞凋亡。研究发现，STW能够改善POI小鼠的整体健康状况，恢复激素平衡，正常化发情周期，并促进卵泡发育和子宫内膜修复。通过对小鼠进行的蛋白质组学分析和分子对接验证，研究者们确认STW的主要成分如黄酮类化合物（如芦丁和山奈酚）与POI相关基因相互作用，进而激活EGFR/PI3K/AKT通路，从而抑制细胞凋亡，改善卵巢和子宫的功能。此外，STW对POI的治疗效果不仅限于卵巢，还包括对子宫的积极影响，强调了卵巢与子宫之间的协调作用。这一发现为POI的分子机制提供了新的见解，并支持STW作为一种潜在的治疗策略，针对卵巢-子宫轴进行干预。研究结果表明，STW可能通过多靶点、多组织的方式，促进卵泡生长、内膜容受性及激素调节，从而为POI患者提供有效的治疗选择。
在该研究中，研究人员使用了赛昂斯小动物活动记录仪（Sansbio，#SA704）来进行实验操作。
SA704 小动物活动记录仪
小动物活动记录仪广泛应用于神经科学与行为学研究（如运动功能、焦虑、抑郁、认知障碍研究）、神经退行性疾病模型评估（如帕金森病、阿尔茨海默病）、代谢与肥胖研究（如能量消耗、活动节律分析）、睡眠与昼夜节律研究、疼痛模型与康复评估、运动能力与疲劳研究、药物筛选与药效学评价，以及心血管、代谢综合征、老龄化等疾病状态的长期监测，为探索疾病机制、行为变化规律和治疗效果提供关键数据支持。
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