凝血分析有什么意义肝细胞癌的免疫浸润和凝血相关基因的临床意义分析

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背景

①恶性肿瘤患者易出现静脉血栓栓塞并发症（VTE），而门静脉血栓（PVT）是HCC患者最常见的并发症。②一项对人类肿瘤凝血组的泛癌分析显示，凝血与肿瘤免疫微环境(TME)有关。此外TME被认为在HCC的发展中起着关键作用。③肿瘤凝血体是一个由癌症驱动的有利于血栓形成或出血的分子效应物网络，凝血体可以与TME相互作用，协调肿瘤的进展或抑制，甚至影响肿瘤的免疫反应。④抗凝血剂可能是免疫检查点阻断剂（ICB）的有效辅助治疗。初步临床研究表明，直接口服抗凝剂（DOAC）利伐沙班增强了ICB对恶性黑色素瘤的作用。

基于以上四点的理论支持，作者探究了不同凝血亚型的免疫特征和预后分层的差异，构建了凝血相关风险预测模型，并进行了验证。

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数据来源

凝血途径从KEGG数据库收集，包括hsa04610（补体和凝血级联Complement
and coagulation cascades）和hsa04611（血小板激活Platelet activation）这两条途径中共300个凝血相关基因（CRGs）。肝细胞癌的基因表达谱和相应的临床数据集收集自GEO、TCGA和ICGC。两个静脉血栓栓塞性并发症VTE队列 GSE19151和GSE48000。两个门静脉肿瘤血栓形成PVTT队列GSE69164和GSE77509 。1个经导管动脉化疗栓塞术（TACE ）队列GSE104580。IMvigor210队列包括完整的表达数据和接受抗PD-L1药物治疗的转移性尿路上皮癌患者的详细临床信息。黑色素瘤患者接受抗PD-1和抗CTLA4治疗队列GSE91061。包含接受抗PD/抗PD-L1治疗的HCC患者的生存信息队列GSE140901。

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CRG的体细胞改变情况

首先作者观察了300个凝血相关基因的体细胞突变情况，DNA的改变包括突变（截断和错义）和拷贝数改变（扩增和深度删除）两大类，作者也从这两方面入手。对于突变情况，图A示，约65.9%的患者发生了CRGs的DNA突变，CRGs的整体DNA突变水平从2％到5%不等。突变频率最高的CRG是ITPR3（5%）、PIK3CA（5%）、ADCY2（5%）、C3（5%）和ITPR1（5%），其主要突变方式是错义突变、框架转移突变、框架内突变和无义突变。尽管CRGs的突变频率并不高，但拷贝数改变占了DNA改变的大多数。图F示约66.57%的HCC患者至少有一个CRG的拷贝数改变。在有较高的扩增改变频率的CRGs中，像ADCY8、FCER1G、FCGR2A、CFH、CFRH3、CFRH1、CFRH2、CFRH4和CFRH5，但几乎没有深度缺失（图G）。因此，大多数具有高拷贝数变异频率的CRG趋向于共同扩增而不是共同删除。C图我们可以看到拷贝数改变的患者的多个肿瘤抑制基因比例较高，如TP53、PKHD1L1和CTNNB1。D、E图KM生存曲线显示，低CNA频率的患者比高CNA频率的患者有更长的OS和DFS。但作者在突变组中没有发现相似规律。

综合以上，我们可知体细胞拷贝数改变是HCC中CRGs失调的主要原因，而不是突变，并可能导致预后不良。

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鉴定HCC的凝血亚型

接下来作者采用名为pam的无监督聚类方法确定了两种凝血相关的聚类模式（图A），在主成分分析进一步得到了证实（图B）。接着在有生存信息的HCC队列（TCGA、ICGC和GSE14103）评估两个集群的生存差异，明显可以看到集群1的生存优于集群2（图C）。D图探讨了两个集群与各种临床特征之间的关系，集群1的患者比集群2的患者有更高的组织学G1、儿童1级、TNM I-II期和存活的比例。热图则显示了两种凝血亚型中差异表达的CRGs的表达特征和相应临床信息（图E）。

以上结果表明，CRG可能通过一些潜在的机制影响肿瘤的发展。

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凝血亚型的免疫景观

通过GSVA，作者揭示了两凝血亚型间不同的免疫浸润模式。集群1对免疫和炎症通路（包括T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、结节样受体信号通路、toll样受体信号通路和趋化因子信号通路）和肝癌干细胞信号调节通路（notch信号通路和wnt信号通路）有显著富集（图A）。GSEA也证明了两亚型中存在免疫途径的差异，集群1中高表达的DEGs在T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、Th1和Th2细胞分化和Th17细胞分化中明显富集（图B）。作者接着观测了免疫细胞的分布情况，亚型1的特点是B细胞、CD8 naive、CD4 naive、CD4 T、CD8 T、NKT、Th1、Tfh（滤泡辅助T细胞）和Tcm（中心记忆T细胞）的高浸润，而亚型2的特点是DC（树突状细胞）、iT
reg（诱导性调节T细胞）、nTreg（自然调节T细胞）、Th17、单核细胞和中性粒细胞的高浸润（图C）。作者也计算了评价肿瘤微环境的指标如基质评分、免疫评分、ESTIMATE评分等，可以看到集群1的样本评分明显高于集群2样本（图D），图D、E是两亚型与主要组织相容性复合体和T细胞刺激物的关系。除HLA-B和HLA-C外，主要组织相容性复合体和T-细胞刺激物的表达水平在集群1中更高。

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凝血亚型与免疫治疗效果关联

背景知识提到，抗凝剂与免疫治疗效果之间可能存在联系，而TMB评分、TIDE评分和免疫检查点分子的表达水平可以侧面反映患者对免疫检查点抑制剂的反应。与集群2相比，集群1的PD-1、PD-L1、CTLA4、HA VCR2、LAG3和TIGIT的表达水平明显更高，TMB评分、TIDE评分也是如此。此外，作者计算了HCC常用化疗药物的IC50，以评估两种凝血亚型的药物敏感性。索拉非尼、多柔比星、长春碱、索拉非尼和顺铂的IC50值在集群1中高于集群2。

总结来说，集群1对免疫疗法表现出更好的反应，集群1对化疗药物有良好的效果。

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关键CRGs的识别

在识别凝血相关关键基因过程中，通过蛋白互作网络和degree、MNC两种拓扑算法，筛选出共20个关键基因。但仅基于算法的结果可能缺乏实际生物学意义和可靠性，所以作者借助包含深静脉血栓样本和正常样本的数据集GSE19151来进一步筛选关键CRGs。在VTE和正常样本之间共鉴定出740个DEGs，取交集一共得到三个基因，分别是PRKACA,PIK3R1 和 ITGB2。接着作者在泛癌中观察这三个基因的表达情况，PRKACA和ITGB2在大多数癌症的肿瘤样本中都是上调的，PIK3R1主要在LIHC、THCA和KIRP中是上调的。三个关键CRG在KIRC、KIRP、LIHC和THCA中都显示出扩增的表达模式。

结果表明，关键CRGs在多种癌症中发挥着保护作用。

接着，作者在两个HCC队列（ICGC和GSE14520）和两个VTE队列（GSE19151和GSE48000）探索了这三个关键CRGs的表达水平。在HCC队列中，只有PIK3R1在癌症样本中上调，而ITGB2和PRKACA的表达在癌症组和正常组之间没有统计学差异。PIK3R1也是两个VTE队列中三个关键CRG唯一表达不同的。因此，作者着重研究了PIK3R1异常表达背后的机制。PIK3R1的拷贝数变异频率高于其他两个关键CRG，而且缺失占所有类型的大部分（图C）。甲基化分析显示，肿瘤组的ITGB2和PIK3R1的β值高于正常组，而PRKACA则完全相反（图D）。基因表达与甲基化程度呈负相关，而CNA的丰度对基因表达有积极影响。总结来看，PIK3R1的异常表达，主要是因为SCNA和甲基化。

为了研究关键CRG对生存的预测价值，作者进行了单变量Cox回归。只有PIK3R1可以作为HCC的一个很好的保护因素（图E）。作者又观察了高低PIK3R1组之间HCC的OS，PIK3R1高表达和较好的OS有关。多变量Cox回归得到PIK3R1是一个独立的预后因素。结果表明，凝血途径与HCC的生存率再次明显相关，这表明关键的CRG——PIK3R1可能是一个保护因素，对恶性肿瘤患者具有优越的预测价值。

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凝血相关HCC预后signature

通过LASSO回归，作者构建凝血相关风险评分模型（CRRS）。用于建模的11个基因和OS的关系（图C）：SERPINA1、PLCB3、PIK3R6和PPP1CB的表达水平对较差的预后有积极贡献，而GP6、P2RX1、PLA2G4F、PLCB4、GP1BA、PIK3R1和CFHR3的表达水平起到相反作用。桑基图展示了凝血亚型、CRRS评分和生存状态之间的联系。作者使用COX回归的C指数还有ROC曲线的AUC来评价模型的预后预测能力，可以看到，联合模型的C指数最高，与其他单一特征相比，联合模型具有最大的AUC，即最佳的预后预测效率。

作者接着用该模型在TCGA、ICGC中验证，C图的KM曲线能看出，高风险组的OS比低风险组差。在TCGA上1年、3年和5年预后预测的平均AUC值达到0.799、0.799和0.801。ICGC预测1年、2年和3年生存率的平均AUC值为0.65、0.67和0.704。这些结果表明CRRS在区分肿瘤结局差异方面的可靠能力。

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基于风险评分的HCC治疗策略

和上文凝血亚型对免疫治疗反应不同类似，作者在这里比较了在高风险组和低风险组之间5个免疫检查点分子（PD1、PD-L1、CTLA4、LAG3和HA VCR2）的表达。三种免疫检查点分子（PD-L1、CTLA4和LAG3）在高危组中明显上调。IPS、IPS-CTLA4、IPS-PD1和IPS-PD1-CTLA4得分是评价检查点抑制剂有效性的定量指标，其在高风险组中更高。此外，高危组的TMB和TME评分较高，而TIDE评分较低（图C，D和E）。

根据上述分析，凝血亚型和免疫微环境有明显的相关性，作者尝试研究CRRS是否能预测HCC的免疫治疗反应。由于HCC免疫治疗数据库（GSE140901）中的病例相对较少，因此选择了样本接受抗PD-L1治疗的尿毒症队列（IMvigor210）和样本接受了抗PD-1和抗CTLA4治疗的恶性黑色素瘤队列（GSE91016）。不同反应组之间的风险评分存在明显差异（图H、I）。接着又按风险评分分为高低风险组，在IMvigor210队列和GSE140901中，低风险组的患者的OS明显长于高风险组患者，而在GSE91061队列中，两组患者的生存期没有明显差异（图F、G）。这些结果表明，低风险组比高风险组的患者对免疫治疗有更好的反应。这也可以解释为什么低CRRS的HCC患者比高CRRS的患者表现出更好的生存率。

作者也探索了在接受TACE治疗的HCC患者中CRRS对治疗反应的预测价值。结果包括TACE反应和TACE抵抗。TACE反应组的CRRS高于TACE抵抗组（图A）。ROC曲线显示CRRS对识别TACE耐药性显示出很大的诊断价值（AUC=0.71）。有PVTT（门静脉癌栓）的HCC患者比没有PVTT的患者拥有更高的CRRS。作者也计算了每个HCC患者的六种常见化疗药物的IC50值。高CRRS亚组对大多数药物都很敏感，除了Roscovitine（CDK抑制剂）。

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CRRS为HCC的独立预后因素

由于CRRS与HCC的高恶性度和晚期肿瘤显著相关，作者通过单因素和多因素的Cox回归分析来确定CRRS是否是HCC患者的一个临床独立预后因素。年龄、分期和CRRS是可以用来预测HCC患者预后的独立因素（图A、B）。通过结合独立的预后因素，作者构建了一个列线图，作为临床相关的定量方法。此外，多个队列（TCGA、ICGC和GSE76427）的校准图表明，列线图与理想模型的性能相似（图E）。不同变量的时间依赖性C指数曲线显示，与其他单一因素相比，nomogram的性能最佳（图D）。三个队列的时间依赖性ROC也显示，列线图具有较高的预测能力（图F）。

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小结

本篇文章从KEGG数据库中收集了凝血途径，在肝细胞癌患者中区分了两种与凝血相关的亚型。并证明了两种凝血相关亚型在免疫特征和预后分层方面的明显差异。在TCGA队列中建立了凝血相关风险评分预后模型，用于风险分层和预后预测。还建立了一个列线图，以便于临床使用该风险评分，并使用不同的方法验证。

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