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Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization
作者：Chiara Baccin , Jude Al-Sabah , Lars Velten , Patrick M Helbling , Florian Grünschläger ,Pablo Hernández-Malmierca , César Nombela-Arrieta , Lars M Steinmetz , Andreas Trumpp , Simon Haas (Center for Genomic Regulation, The Barcelona Institute of Science and Technology, Barcelona, Spain. Genome Biology Unit, European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Heidelberg, Germany. Department of Genetics, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA. Stanford Genome Technology Center, Palo Alto, CA, USA. Heidelberg Institute for Stem Cell Technology and Experimental Medicine (HI-STEM gGmbH), Heidelberg, Germany. Division of Stem Cells and Cancer, Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ) and DKFZ-ZMBH Alliance, Heidelberg, Germany. German Cancer Consortium (DKTK), Heidelberg, Germany. Heidelberg Institute for Stem Cell Technology and Experimental Medicine (HI-STEM gGmbH), Heidelberg, Germany. )
发表情况：Nature Cell Biology 2020 Jan;22(1):38-48. doi: 10.1038/s41556-019-0439-6. Epub 2019 Dec 23.
科学问题
骨髓(BM)生态位是特殊的微环境，其中不同的间充质细胞、脉管系统和分化的造血细胞相互作用以调节造血和间充质干细胞的维持和分化。然而，单个标记被用来定义细胞类型，可能导致异质群体的标记。因此为了全面了解BM中的细胞类型和生态位，我们基于单细胞RNA测序生成了所有主要BM群体的分子图。然后，我们使用空间转录组学结合计算工具将细胞类型分配到不同的BM生态位，确定细胞间相互作用的分子介质，并确定生态位因子的细胞和空间来源。
重要发现
Ø 研究结合单细胞和空间转录组学系统地揭示了不同骨髓生态位的分子、细胞和空间组成。
Ø 对所有主要的骨髓细胞类型进行转录分析，鉴定其空间定位并阐明造血因子的来源。
Ø 提出了RNA-Magnet算法可以通过单细胞转录组数据准确推断三维骨髓组织。
中文摘要
骨髓是血液生成和骨骼再生的主要部位。但是，其细胞和空间组织定位仍存在争议。本研究结合单细胞和空间转录组学系统地揭示了不同骨髓生态位的分子、细胞和空间组成。研究者对所有主要的骨髓细胞类型进行转录分析，鉴定其空间定位并阐明造血因子的来源。本研究数据表明，Cxcl12富集表达的网状（CAR）细胞亚群（Adipo-CAR和Osteo-CAR）在窦状小管和小动脉表面差异分布，并在局部充当“专门产生细胞因子的细胞”，从而建立了血管周围的微生态位。重要的是，对单细胞转录组数据使用RNA-Magnet算法可以准确推断三维骨髓组织。总之，研究揭示了骨髓生态位的细胞和空间组织定位，并提供了系统的方法来解析整个复杂的器官组织。
英文摘要
The bone marrow constitutes the primary site for life-long blood production and skeletal regeneration. However, its cellular and spatial organization remains controversial. Here, we combine single-cell and spatially resolved transcriptomics to systematically map the molecular, cellular and spatial composition of distinct bone marrow niches. This allowed us to transcriptionally profile all major bone-marrow-resident cell types, determine their localization and clarify sources of pro-haematopoietic factors. Our data demonstrate that Cxcl12-abundant-reticular (CAR) cell subsets (Adipo-CAR and Osteo-CAR) differentially localize to sinusoidal and arteriolar surfaces, act locally as ‘professional cytokine-secreting cells’ and thereby establish perivascular micro-niches. Importantly, the three-dimensional bone-marrow organization can be accurately inferred from singlecell transcriptome data using the RNA-Magnet algorithm described here. Together, our study reveals the cellular and spatial organization of bone marrow niches and offers a systematic approach to dissect the complex organization of whole organs.
结 果
图1：通过scRNAseq鉴定BM驻留细胞类型。
a、用流式分选要测序的骨髓细胞。
b、对测序之后的数据进行降维和t-SNE聚类，并通过相应marker进行细胞注释。得到7,497个细胞，共分出32个亚群，分别对应于不同的细胞类型或分化阶段，利用marker基因的表达，GO分析等方法对细胞类型进行判断，鉴定出主要的造血细胞类型，包括树突状细胞，嗜中性粒细胞，单核细胞，不同发育阶段的T细胞和B细胞，以及CD45低表达并表达红系细胞marker（如CD71）的红系祖细胞。
图2：BM细胞类型的表征。
a、Sca1 (Ly6a), endomucin (Emcn), nestin (Nes) and ng2 (Cspg4)的表达水平，MAGIC用来估算离群值。
b、用抗Sca1和Emcn抗体免疫染色的骨髓切片图像。实验独立重复十次，结果相似。
c、在先前发表的相关基因标记人群的bulk转录组中富集Adipo-CAR细胞(左)、Osteo-CAR细胞(中)和ng2+ MSCs(右)细胞的基因表达特征。使用CIBERSORT算法。
d、Adipo-CAR (n = 528)、Osteo-CAR (n = 57)和成骨细胞(n = 53)群体中选定基因的比例表达水平的箱线图。
e、使用RNA velocity算法做间充质干细胞发育路径的推断，总共1784个细胞。
f、对用于scRNAseq的不同细胞分离方法获得的细胞类型比例的比较。
图3：通过整合单细胞和空间转录组学进行BM驻留细胞类型的空间定位。
a、对骨切片(12 m)进行小动脉(Sca1)和窦道(Emcn)染色。使用激光捕获解剖收集动脉(暗黄色方框)、窦(黄色方框)和内膜(蓝色方框)周围约14，500平方米的区域，以及无血管区域(灰色方框)和内膜下区域(蓝色虚线方框)，并进行RNA-seq。。
b、成骨细胞、血窦和小动脉特异性基因在scRNAseq数据(10x)和来自不同生态位的空间转录组学(LCM，LCM-seq数据)中的表达。
c、在小生境间有差异表达的基因中富集群体标记基因。
d、计算数据分析策略的概要示意图。
e、显微镜下不同生态位中不同细胞类型的估计丰度。显示了CIBERSORT估计值的平均值；误差线表示平均值的标准误差。
f、总结e数据的热图。
图4：用免疫荧光测定CAR细胞亚群的定位。
a、Cxcl12和Alpl的单细胞基因表达水平。MAGIC用于估算离群值。
b、其他感兴趣的高分辨率区域，分别显示Cxc-GTF和Alpl信号。
c、从面板中三维分割感兴趣区域。
d、碱性磷酸酶（Alpl）阳性骨细胞(红色)和碱性磷酸酶阴性脂肪细胞(绿色)在中央骨髓窦状小管和非窦状小管生态位中的定量分布。
e、来自d的数据显示为直方图；有2489个通过显微镜分析的细胞。
f、Cxcl12–GFP小鼠股骨的整体影像学，对Alpl和小动脉标记物Sca1进行染色。箭头指向靠近Sca1+小动脉内皮细胞但不与之重叠的Alpl+Cxcl12+细胞。
图5：使用免疫荧光进行其他间充质细胞类型的定位。
a、SM22 (Tagln)和Pdpn的单细胞基因表达水平 (左)。骨髓小动脉(中心)中SM22、Pdpn和CD31的免疫荧光染色。骨髓小动脉中Pdpn、Sca1和Pdgfra的免疫荧光染色(右)。
b、Col1a1和Pdpn的单细胞基因表达水平 (左)。内皮表面Col1a1、Pdpn和DAPI的免疫荧光染色(右)。
图6：RNA-Magnet从单细胞基因表达数据中预测细胞相互作用。
a、t-SNE突出显示每个细胞最有可能发生物理相互作用的细胞类型和估计的粘附强度(RNA-Magnet粘附性，用不透明度表示)。
b、将估计的粘附强度(RNA-Magnet评分)与每种细胞类型在生态位之间的差异定位程度进行比较(空间转录组学)。显示了25种细胞类型，所有HSPC亚型被总结为单一群体。显示了皮尔逊相关及其相关的P值。
c、热图描述了基于RNA-Magnet推断的定位的概要(左)。根据图例，分配给特定生态位的细胞部分用颜色区分。在n = 3个生态位中，定位的RNA-Magnet估计和定位的LCM-seq估计之间的皮尔逊相关性(右)。
图7：BM中关键细胞因子的细胞和空间来源。
a、不同细胞类型对不同细胞因子池的贡献。比较构成每种细胞类型的所有细胞的平均基因表达。
b、CD45-Lin-CD71-Vcam 1+细胞中Cd200和Itgb3 (CD61)的单细胞基因表达水平。MAGIC44用于估算离群值。
c、CD45-Lin-CD71-Vcam1+细胞中CD200和CD61的表面标记水平。
d、流式分析总骨髓、谱系阴性骨髓、Lin-CD31+内皮细胞和CD45-Lin-CD71-CD51+Vcam1+CAR细胞的CD61/CD200亚群中Cxcl12的表达。
e、每种细胞类型表达的生长因子和细胞因子的数量，以及总基因中用于产生生长因子和细胞因子的部分。
f、细胞因子和绿色荧光蛋白在脂肪细胞和成纤维细胞中的相对表达。
g、根据空间转录组学数据，在指定的生态位中Cxcl12(左)、Kitl(中)和所有细胞因子和GFs的总和表达。
h、细胞因子、趋化因子和绿色荧光蛋白在不同生态位的表达。只包括生态位之间有显著差异的因子。
图8：BM中信号的系统分析。
a、 用RnA-Magnet推断细胞类型之间的信号相互作用。如果一种细胞类型富含由第二种细胞类型表达的受体配体的表达，则在这些细胞类型之间画一条线，颜色表示产生配体的细胞类型，线宽表示富集的强度。
b、 根据LCM-seq估算的生态位组成概要。
c、 生态位和细胞类型之间信号相互作用的推断。线宽表示配体-受体对表达的富集强度。
总 结
在这项研究中，研究者结合了单细胞和空间转录组学来定位所有主要的BM细胞类型，并将它们在空间上分配给不同的BM生态位。数据阐明了调节BM造血功能的关键细胞因子的细胞和其空间起源。关键的HSC因子（例如Cxcl12和Scf）主要由两个截然不同且以前未被认识的细胞亚群产生，根据它们的基因表达谱，我们将其称为Osteo-CAR细胞和Adipo-CAR细胞。除干细胞维持因子外，CAR细胞亚群在所有BM细胞类型中产生最多的细胞因子，包括介导骨髓样和淋巴样细胞分化的主要细胞因子，这与最近的研究表明IL7和Cxcl12是由同一BM细胞类型产生相符。表明CAR细胞充当“专门产生细胞因子的细胞”，并构成协调不同方面造血功能的中枢生态位细胞。Adipo-CAR细胞位于窦状小管血管内皮，Osteo-CAR细胞则位于非血管区域或小动脉内皮。因此，与非血管和骨内膜生态位相比，在窦状小管和小动脉生态位中都可以观察到大量的干细胞维持和分化因子。总之，这表明小动脉和窦状小管血管支架均是产生HSC维持和分化所需因子的关键部位，其中Adipo-CAR细胞和Osteo-CAR细胞亚群构成了中枢细胞中心。综上，本研究方法结合了scRNA-seq和空间转录组学方法，揭示了BM生态位的分子、细胞和空间组织定位，并提供了系统的方法来解析整个复杂的器官组织。
