动作电位（APs）之后会有一段兴奋性降低的时期，称为不应期。因此，高频放电需要特殊的适应性来最小化这个不应期并维持动作电位的稳定性。在高频放电时发生的动作电位波形变化在前突触终末尤其重要，因为动作电位的形状通过电压依赖性钙通道关键控制钙内流，进而控制递质释放。动作电位之后，恢复期间的膜电位对电压依赖性钠通道失活的恢复速度和电压依赖性钾通道失活的恢复速度有很大影响，这两者是不应期的两个主要决定因素。在一些终末，动作电位之后会出现去极化后电位（DAP），而在另一些终末则观察到超极化后电位（HAP）。这种后电位的符号取决于静息电位，这表明动作电位后的膜电位（Vafter）可能比后电位的符号更重要。
Held壶腹是一种谷氨酸能轴体终末，其生物物理特性已被充分研究。它的许多释放位点使其能够在听觉脑干内充当反转中继突触，即使在放电频率>200Hz时，也能可靠地驱动其突触后伙伴——斜方体内侧核（MNTB）中的 principal neuron。在啮齿类动物出生后第2天（P2）左右形成后不久，它在体内就已经以特征性的高频爆发形式放电。在切片研究中，已经观察到较大的去极化后电位，再生钠电流对此有显著贡献，这可能促进高频放电。除了小脑苔藓纤维终末外，对哺乳动物突触前终末生物物理特性的研究都是在离体条件下进行的，后电位的功能意义，包括它们在自然放电模式中的作用，目前基本未知。在这里，我们对幼鼠Held壶腹进行体内近细胞和全细胞记录，并研究后电位在自然放电模式中对突触前动作电位稳定性的贡献。
一、结果
01. 体内壶腹的鉴定
为了研究生理放电过程中动作电位抑制的作用，我们对2-8日龄幼鼠的Held壶腹进行了盲法近细胞和全细胞记录。几条一致的证据表明，我们确实记录到了听觉脑干中的巨大终末Held壶腹。首先，通过生物素填充和随后的组织学处理证实了几个壶腹的身份，显示出壶腹典型的杯状形状和通常可以追溯到中线和MNTB同侧其他听觉核团的轴突。其次，与之前在切片中的壶腹记录一致，终末对恒流注射的反应是在电流注射开始时出现单个、短暂且超射的动作电位、强外向整流和超极化激活的去极化电压下陷。第三，在一些记录中，壶腹动作电位之后有一个小的偏转，这可能反映了突触后动作电位。第四，终末表现出特征性的放电模式，由高频微爆发组成。其间隔分布类似于该年龄的听神经活动，这与其由耳蜗产生一致。与体内突触后记录不同，在电压钳模式下未观察到快速突触瞬变，这与轴突-轴突输入的缺失一致。因此，我们记录的结构极有可能是壶腹。
图1. 建立Held壶腹的体内记录。（A）P6大鼠腹侧脑干冠状切片，包含MNTB（轮廓），用抗生物素（绿色）、抗囊泡谷氨酸转运体1和2（橙色）和核苷酸染色Sytox Blue标记。中线位于左侧，腹侧位于底部。（B）壶腹的体内全细胞记录（左）；在恒流注射时（上），终末显示去极化下陷、强外向整流和单个动作电位（下）。蓝色轨迹表示引发动作电位的电流阈值。串联电阻离线补偿。（C）在一些记录中，诱发和自发动作电位之后有一个峰后电位（箭头），表明存在类似于突触后记录中可记录到的突触前电位的突触后动作电位。（D）在电压钳记录中，可以记录到自发活动期（上），由微爆发组成（下）。上记录中约2Hz的电流幅度振荡是由呼吸引起的。（E）D的扩展显示两个峰后电位（箭头），以及缺乏突触电流。对于D和E，指令电位为-80mV；串联电阻（36MΩ）未补偿。
图S1. 体内全细胞记录期间壶腹主动和被动特性的发育变化。（A，上）恒流注射的示例轨迹描绘了电压下陷和外向整流。轨迹用双指数函数拟合（绿色虚线）。（下）在电流注射结束时获得拟合的稳态值（绿色圆圈）或记录值（黑色圆圈），并相对于电流幅度绘制。斜率电阻（虚线）通过线性拟合获得。（B）自发动作电位（下）和恒流注射诱发的动作电位（上）的示例。（C）串联电阻与幼鼠年龄的关系。串联电阻根据参考文献22中所述，从电压钳记录中计算（未显示）。（D）瞬时斜率电阻（A中的绿色虚线）与幼鼠年龄的关系。（E）由超极化电流注射计算的斜率电阻（A中的黑色虚线）与幼鼠年龄的关系。（F）由去极化电流注射计算的斜率电阻（A中的蓝色虚线）与幼鼠年龄的关系。外向整流显著降低了斜率电阻。（G）诱发（黑色圆圈）和自发动作电位（蓝色菱形）的最大上升速率与幼鼠年龄的关系（B中的标签）。（H）诱发（黑色圆圈）和自发动作电位（蓝色菱形）的最大复极化/下降速率与幼鼠年龄的关系。（I）诱发（黑色圆圈）和自发动作电位（蓝色菱形）的半宽度与幼鼠年龄的关系。（J）自发动作电位的Vafter与幼鼠年龄的关系。数据点表示壶腹。G-I中的线连接从同一壶腹记录的自发动作电位（蓝色菱形）和诱发动作电位（黑色圆圈）。
图S2. Held壶腹体内近细胞记录中自发放电的偏好频率。（A）上图显示按幼鼠年龄分组的单个近细胞记录的概率密度图（灰度）。下图在半对数图上显示不同幼鼠年龄的平均概率密度与峰间期（ISI）的关系。（B）平均和最小微爆发间隔（即间隔<40ms）与幼鼠年龄的关系。（C）最大瞬时频率与幼鼠年龄的关系。（D）动作电位半宽度，估计为eAP峰-峰间隔，与幼鼠年龄的关系。对于B-D，圆圈代表单个近细胞记录的壶腹。
在新生的最初几天，终末呈现杯状。伴随着这种结构发育，其生物物理特性发生了许多发育变化，包括静息膜电阻的发育性降低和外向整流的显著增加，最大上升速率增加、复极化速率增加的发育趋势，以及动作电位半宽度的明显缩短。短暂电流注射诱发的动作电位显示出类似的发育变化。这些发育变化加速了终末的动作电位，允许以更短的间隔放电。令人惊讶的是，即使是P2-P3的壶腹也能在150Hz以上自发放电而没有明显的失败，这表明其在形成后不久就已经具备了高频放电的能力。
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02. 体内抑制的抗性
在高频放电期间，突触前动作电位的形状在全细胞和近细胞记录中都保持显著恒定。图2A和B显示了一个代表性的全细胞记录中动作电位的最大上升速率与动作电位间隔的函数关系。虽然突触后躯体动作电位在体内最短间隔时通常抑制>40%，但壶腹动作电位在全细胞记录中间隔<5ms时平均仅抑制4%。近细胞记录获得了类似的值，这表明这一发现既不是冲洗的结果，也不是Rs相关电容滤波的结果。此外，在一个微爆发内，第三个动作电位的最大上升速率与第一个动作电位相似，考虑到高频放电和动物的年轻年龄，这显示出显著的稳定性。此外，在高频爆发后，定义为-35mV处动作电位宽度的半宽度仅增加4±1%。在近细胞记录中，动作电位半宽度最好用正负峰之间的延迟来表示，同样，在近细胞模式下，这种延迟增加了4.0±0.7%。半宽度的变化与动作电位抑制相关。我们得出结论，突触前动作电位的形状在高频活动期间几乎没有变化。
图2. 体内放电期间动作电位抑制很少。（A，左）体内全细胞记录（WC）显示壶腹爆发活动期。（中）高频微爆发。（右）四个动作电位的叠加。（B）体内近细胞记录（juxta）显示与A类似的活动，右侧显示五个细胞外动作电位（eAPs）的叠加。（C）单个全细胞记录中最大上升速率与动作电位间隔的关系。（插图）相对于前一个动作电位的最大上升速率与动作电位间隔的关系显示在短间隔时有小但明显的抑制。计算灰色区域内间隔的平均值以进行记录间比较。（D，左）间隔小于5ms时的相对幅度显示出小的抑制。对于WC，显示动作电位上升速率的相对变化；对于juxta，显示eAP幅度的相对变化。（右）间隔<5ms时动作电位半宽度的变化。（E，上）20秒的恒流注射，伴有自发爆发放电。恒流注射从-120pA开始（最低轨迹），递增60pA（蓝色阴影表示）。（下）动作电位最大上升速率与起始电位的关系。橙色-绿色相连的圆圈对对应于一对动作电位，其中第一个动作电位（AP1）之前300ms内没有动作电位（绿色），第二个动作电位（AP2）在20ms内跟随AP1（橙色）。（F）E中第二个动作电位的相对上升速率与AP1起始电位的关系。红色虚线显示线性拟合。与黑色虚线（AP2/AP1等于1）的交点在-64.9mV处。（G）稳定电位（Vstab）与静息膜电位（RMP）的关系。线性相关性不显著[r=0.5；F(1,7)=2.8；P=0.14]。C和E中的圆圈表示动作电位。D和G中的开放标记表示记录的壶腹；封闭标记对应平均值。F中的圆圈表示动作电位对。条形表示标准误。
图S3. 高频放电期间动作电位半宽度调制最小。（A）P5壶腹全细胞记录中动作电位半宽度与动作电位间隔的关系。（插图）相对于前一个动作电位的动作电位半宽度与动作电位间隔的关系。（B）动作电位半宽度的相对大小与近细胞eAPs幅度（菱形）或全细胞动作电位上升速率（圆圈）的关系。线表示回归线[r=-0.55；t(23)=2.9；P=0.004]。
接下来我们研究了哪些机制导致了突触前动作电位形状的显著稳定性。在短间隔时，动作电位后的膜电位（Vafter）将决定下一个动作电位的起始电位。为了观察Vafter如何影响下一个动作电位的上升速率，我们比较了长去极化或超极化电流注射期间的连续动作电位对。有趣的是，如果壶腹膜电位处于超极化状态，第二个动作电位将在比第一个更去极化的电位开始，并且相对抑制；相反，如果第一个动作电位在去极化电位开始，第二个动作电位将在更超极化的电位开始，并且与第一个相比增强（图2E）。为了找到抑制转为增强的电位，我们将第二个动作电位上升速率的相对变化与第一个动作电位的起始电位作图（图2F）。通过线性回归获得动作电位大小稳定时的电位（稳定电位Vstab）。该稳定电位接近静息膜电位（RMP）（图2G），表明当Vafter接近RMP时，动作电位在高频放电期间的上升速率变化最小。我们无法确定动作电位半宽度的Vstab，因为半宽度调制与起始电位不呈线性变化，可能是由于其他电压依赖性离子通道的失活所致。尽管如此，半宽度调制范围有限（0.95–1.05）。因此，我们从体内测量得出结论：如果动作电位之间的膜电位接近RMP，动作电位波形在高频放电期间保持稳定。
在切片研究中，壶腹动作电位通常伴随3–12 mV的去极化后电位（DAP），但在体内17次记录中有7次观察到超极化后电位（HAP）（图3A，插图）。后电位在发育过程中没有变化（r = −0.1；n = 17个壶腹）；它确实依赖于RMP，后电位的方向在−71.3 ± 0.8 mV处反转（r = −0.88；n = 17个壶腹；图3A）。为了分析当动作电位从不同膜电位开始时Vafter如何变化，我们再次观察长恒流注射。在动作电位从−75 mV或更负电位开始的所有记录中，动作电位峰值后1.8 ms测量的Vafter似乎基本独立于动作电位的起始电位（图3A），而在电位比−70 mV更正时，Vafter随动作电位起始电位每变化1 mV去极化+0.58 ± 0.03 mV（平均值±标准误；n = 5个壶腹；图S4）。我们不关注动作电位前后膜电位的差异，而是关注动作电位后的膜电位绝对值（Vafter），这对下一个动作电位的影响更重要。
图3. 体内高频放电期间，动作电位之间的膜电位接近动作电位稳定电位。（A）由于恒流注射，五个具有不同起始电位的自发峰值对齐动作电位。后电位在动作电位峰值后1.8 ms（箭头）测量。（插图）后电位幅度与静息膜电位（RMP）的关系。圆圈颜色表示幼鼠年龄；黑色、蓝色、绿色、品红色和橙色分别为<P4、P4、P5、P6、>P6。（B，上）具有HAP的高频爆发，以及增强的动作电位幅度（插图）。（下）Vafter与起始电位（Vstart）的关系。灰色圆圈为单个动作电位；绿色–橙色成对圆圈对应一对连续动作电位，其中第一个动作电位（绿色）之前300 ms内无动作电位，第二个动作电位（橙色）在20 ms内跟随第一个动作电位。箭头表示每对Vafter–Vstart的变化。（C）稳定电位Vstab与后电位Vafter的关系。虚线表示线性拟合[r = 0.7；F(1,7) = 6.6；P = 0.04]。相关性表明Vafter与Vstab匹配。对于A和C，每个圆圈对应不同的壶腹。
图S4. Vafter随恒流注射和爆发活动变化。（A）长时恒流注射期间，自发动作电位的Vafter与起始电位的关系。绿色–橙色圆圈对对应一对动作电位，其中第一个动作电位（绿色）之前300 ms内无动作电位，第二个动作电位（橙色）在20 ms内跟随第一个动作电位。虚线表示恒等线。高频放电期间，Vafter主导后续动作电位的起始电位。（B）动作电位起始电位与Vafter关系的模型图。对于超极化起始电位，Vafter将达到恒定膜电位（此处为−71.3 mV）。在去极化电位时，后电位以+0.58 mV/mV去极化，可能是由于对抗去极化的Kv1等钾通道失活（图S5）。（C）上图显示爆发期间后电位（品红色圆圈）去极化的活动期示例。（校准条：2 mV，0.2 s。）下图，单个P6记录中活动期内后电位与动作电位相对位置的关系。蓝线表示RMP。活动期间，后电位去极化，从而从HAP切换为DAP。（D）跨记录的活动期内后电位相对变化与动作电位相对位置的关系。
在爆发活动期间，Vafter成为下一个动作电位的起始电位，这可能使爆发期间的起始电位保持稳定。事实上，在高频放电时，动作电位的起始电位与其前一个动作电位的Vafter重叠（图3B），当后电位超极化时，下一个动作电位可能增强（图3B）。此外，Vafter接近Vstab（图3C）。在活动增加期间，Vafter变得更去极化，后电位可从超极化切换为去极化（图S4）。平均而言，活动期间后电位去极化1.7 ± 0.2 mV [平均值±标准误；n = 9个壶腹；配对t检验AP1 vs. AP15：t(8) = 8.5，P < 0.01]，尽管这种变化具有统计学意义，但起始电位的微小去极化只会对动作电位特性产生最小影响（图2E）。考虑到活动期间后电位变化较小，我们得出结论：Vafter提供了一个稳定的动作电位起始电位，使动作电位波形保持不变。
03. 切片中的抑制抗性
我们体内记录的两个局限性是与高串联电阻相关的低通滤波，以及无法系统测试不同传入活动模式。因此，我们还在急性脑干切片中进行了壶腹记录。通过放置在中线的双极刺激电极刺激传入纤维。通过这种方法，我们测试了在超过体内观察到的频率（>400 Hz）时抑制是否更显著。在生理温度下，壶腹能够以这些频率放电，动作电位上升速率在2–3 ms间隔时抑制至0.88 ± 0.02（平均值±标准误；n = 17；年龄P4–P9）。在17个终末中的16个，我们可以同时确定Vstab（−70 ± 1 mV；平均值±标准误）和Vafter（−71 ± 1 mV；平均值±标准误）。两者再次紧密匹配（r = 0.9；图S5）。在2 mM钙中，Vafter没有变化[n = 6；ΔV = 0.3 ± 0.8，t(5) = 0.9，P = 0.8；图S6]，表明钙通道或钙激活通道在设定Vafter中的作用有限。此外，未发现XE991（10 μM）对后电位有影响[n = 5；ΔV = −0.6 ± 0.7，t(5) = 0.1，P = 0.5；图S6]，表明Kv7通道对后电位的前几毫秒没有显著贡献。最后，我们量化了不同动作电位间隔（2–100 ms）序列中动作电位形状的稳定性。第一个动作电位的波形与序列中的其他动作电位不同（图S7）。第一个动作电位对电流注射敏感（r = −0.95），而第二至第五个动作电位没有变化（r范围为−0.4–0.2；图S7），再次表明后电位稳定了壶腹动作电位的形状。
图S5. 切片记录中动作电位稳定电位Vstab与Vafter相关。（A）恒流注射期间，在中线刺激壶腹轴突以诱发间隔3 ms的双脉冲。P5壶腹的动作电位对齐于第一个动作电位的峰值。刺激伪迹已减去。（B）动作电位最大上升速率与起始电位的关系。双脉冲用绿色–橙色圆圈表示并由箭头连接。箭头方向反转，提示存在稳定电位。此外，注意到由于起始电位改变导致的动作电位稳态抑制。（C）Vafter与起始电位的关系。起始膜电位小于−70 mV时，Vafter相对恒定。虚线为恒等线。（D）双脉冲的动作电位相对上升速率与第一个动作电位起始电位的关系。红色虚线表示接近1的数据点的线性拟合。（E）Vstab与Vafter的关系。红色虚线表示回归线（r = 0.9）。
图S6. 后电位与钙浓度或Kv7通道无关。（A）显示P8壶腹在细胞外钙浓度为1.2 mM（标准浓度；黑色）或2 mM（蓝色）时记录的25个动作电位的平均值。（B）在细胞外液替换为2 mM Ca²⁺溶液的实验中，起始电位（Vstart；品红色）和Vafter（绿色）的变化。约t = 3 min时，新溶液进入浴槽。阴影区域表示壶腹预期暴露于新细胞外液的时期。每个圆圈代表单个动作电位。A中显示的动作电位来自同一记录。（C）显示P5壶腹在添加10 µM XE991之前（“ctrl”）和之后记录的25个动作电位的平均值。（D）与B类似，但针对Kv7阻断剂XE991。B中显示的动作电位属于同一实验。（E）不同药理学实验的汇总散点图。相连圆圈来自同一记录。未观察到更高细胞外钙浓度对Vstart或Vafter有显著影响。XE991对Vafter无显著影响，但观察到Vstart有去极化趋势[ΔV = 2.2 ± 0.9；t(5) = 1.7，P = 0.07]，如参考文献38所述。
图S7. 高频序列中第一个动作电位后保持稳定。（A）P7切片中通过中线电刺激以不同间隔诱发的序列示例。动作电位特性显示于B和C。刺激伪迹已减去。（校准条：100 mV，2 ms。）（B）动作电位上升速率与序列中动作电位序号的关系。仅从第一个到第二个动作电位观察到明显变化。（C）动作电位半宽度与序列中动作电位序号的关系。（D）恒流注射期间，P6壶腹在偏向起始电位时动作电位上升速率与动作电位序号的关系。第一个动作电位的起始电位用颜色编码。插图显示动作电位上升速率与AP #1起始电位的关系。实心圆圈为序列中的第一个动作电位（AP #1），空心圆圈为序列中的第二个动作电位（AP #2）。AP #1的上升速率与偏向起始电位强相关（r = −0.95），而AP #2不相关（r = 0.2）。（E）与D相同，但针对动作电位半宽度。
在爆发活动期间，后电位通过失活恢复的时间依赖性和下一个动作电位的稳态通道可用性影响动作电位抑制。为了区分这两种效应，我们对动作电位抑制进行了建模（补充材料和方法）。首先，我们通过电流注射测量了作为起始电位函数的稳态抑制。这些记录表明，动作电位在RMP处略有抑制（Vhalf：−54.8 ± 2.6 mV；k：7.0 ± 0.9 mV；n = 14；平均值±标准误）。然后，我们使用稳态抑制来预测由多个间隔组成的刺激序列诱导的抑制，这些间隔代表类似体内活动并附加2–3 ms间隔（图S8A）。稳态值未能捕捉最短间隔的抑制（一个自由参数，解释方差：60 ± 5%；n = 14；平均值±标准误；图S8C）。如参考文献33所述，添加包括电压依赖性时间常数的抑制恢复，改善了预测（两个自由参数，解释方差：86 ± 2%；n = 14；平均值±标准误；图S8D），表明在最短峰间隔时未达到稳态恢复。达到与下一个动作电位起始电位相关的稳态抑制的96%和98%恢复分别需要2.8 ± 0.2 ms和3.5 ± 0.2 ms（平均值±标准误；n = 14；图S8B），表明体内观察到的间隔足够长以达到稳态恢复。最后，我们测试了使用平均值的模型在多大程度上可以通过使用每个实验中观察到的间隔和起始电位来预测体内的抑制。对于>P4的动物，预测的抑制与观察到的抑制吻合良好（n = 6；r = 0.9），而对于P3–P4，模型低估了体内抑制（−0.16 ± 0.2；n = 3；平均值±标准误；图S8E）。总之，这些发现表明，在P5时，抑制的快速恢复使壶腹能够以高频放电而几乎没有动作电位抑制。
图S8. 结合类似体内活动模式与建模分析后电位对动作电位抑制的影响。（A）由随机顺序的一系列频率组成的刺激模式。该模式用于刺激Held壶腹的传入轴突，以在广泛的不同频率下诱发动作电位放电。（B）动作电位后预期的相对抑制作为Vafter的函数（颜色）。作图假设先前动作电位无残留抑制，且静息膜电位（RMP）为−70 mV。动作电位引起抑制（d）。抑制恢复在延迟后开始，本例中延迟为0.45 ms，因为动作电位首先需要复极化。恢复时间常数和稳态抑制均依赖于Vafter（补充材料和方法）。注意，如果后电位接近RMP，恢复在5 ms内完成。此外，HAP将加速恢复，甚至可能将相对抑制逆转为相对增强，正如体内观察到的那样。（C）记录的动作电位上升速率由完整动作电位抑制模型（恢复加稳态）或其简化形式（稳态或单独恢复；补充材料和方法）拟合。显示单个记录由不同模型拟合的结果。左图显示动作电位上升速率与峰间隔的关系（记录值，灰色圆圈；模型预测，蓝色十字），顶部显示记录值与预测值的差异（黑点）。右图显示同一数据集的动作电位上升速率与起始电位（Vstart）的关系。仅包括抑制恢复的模型（解释方差：45%）显示残差相对于Vstart存在偏差。另一方面，仅包括稳态的模型（解释方差，87%）在最短峰间隔时显示残差偏差。组合模型很好地描述了数据（解释方差，97%）。（D）不同嵌套模型的解释方差，表明稳态和抑制恢复均对模型有显著贡献。（E）基于平均模型拟合参数、体内记录的峰间隔和体内记录的起始电位，预测抑制量并对间隔（<5 ms）求平均。显示预测的抑制与体内观察到的抑制的关系。虚线为恒等线。空心圆圈表示>P4；实心黑色圆圈表示P3；实心蓝色圆圈表示P4。
04. Held壶腹终末中钠通道的存在
新生Held壶腹以高频放电且极少抑制的能力表明，其在形成后不久即表达相应钠通道。不同出生后年龄的脑干切片用相关抗体进行免疫标记。在早期阶段，整个腹侧听觉脑干已观察到弱表达。免疫标记显示与囊泡谷氨酸转运体的标记重叠，但不与其他蛋白重叠（图4）。在此发育阶段未获得存在相关结构的证据。为确认相应钠通道的突触前存在，研究人员在体内用荧光染料电穿孔标记形成终末的壶腹轴突，并再次对这些终末进行染色。相关信号与电穿孔的轴突共定位；未观察到特定结构（图S9）。令人惊讶的是，相应信号强度在终末本身最高（图S9B），这与先前的报道相反，可能与尚未形成特定结构的早期发育阶段有关。研究人员得出结论，相应钠通道在Held壶腹形成后不久即已存在。
图4. 出生后发育期间相关钠通道的突触前免疫标记。相关结构的共聚焦图像，对相关蛋白和囊泡谷氨酸转运体进行免疫标记，显示最强信号与突触前标记共定位（箭头）。特定抗体标记轴突起始段（*）、郎飞结（#）和相关结构。基于该组抗体无法明确区分相关结构和郎飞结。
图S9. Held壶腹中相关钠通道的免疫标记。（A）相关结构的突触前标记物和相应钠通道免疫标记。下图中的数字对应B中所示的线扫描图。（B）突触前标记物和相应钠通道的免疫标记线扫描图。黑色条表示突触后神经元。相应信号强度峰值与突触前标记物共定位，或比突触前标记物峰值更远离突触后神经元。（C）体内电穿孔壶腹轴突，随后进行相应标记。[比例尺：（A）25 µm，（C）10 µm。]
05. 手术
所有实验均符合相关伦理指南，并经相关伦理委员会批准。手术步骤在参考文献中有详细描述。
06. 体内电生理学和电穿孔
电生理方法的细节已在参考文献中提供。简而言之，使用相关设备在特定电压钳模式或电流钳快速模式下获得全细胞记录。信号经低通滤波，由转换器数字化，并通过软件采集。基于特定成分的pipette内溶液包含多种成分；在某些记录中，向pipette内溶液中添加特定物质。在形成千兆密封前补偿连接电位。论文中报告的所有电位均已校正连接电位。通过定期用特定溶液冲洗和浸没颅骨切开术开口来防止脱水。在细胞贴附模式下补偿杂散电容，获得全细胞配置后，在电压钳中测量串联电阻，但未补偿串联电阻。每个记录流程以短暂的电流注射开始，以记录壶腹的固有特性。还进行了长电流注射，以通过其起始电位评估动作电位特性的变化。还记录了无电流注射的自发活动，以观察自然放电期间的生理动作电位。在少数记录中，在特定电压下进行电压钳记录，未补偿串联电阻。这些记录通常显示由逃避电压钳的侵入性动作电位引起的强内向电流。
由于高串联电阻和高分布pipette电容的组合，pipette的时间常数接近壶腹的时间常数，限制了相关设备的最佳补偿。因此，体内动作电位动力学被低通滤波。为了评估这种滤波效应的影响，研究人员在低串联电阻的切片记录中比较了最佳补偿记录和欠补偿记录。尽管动作电位确实显示出更快的膜电位变化，但在高频放电时观察到的相对抑制量没有变化。
体内电穿孔按参考文献中所述进行。将特定尖端开口的破玻璃pipette填充染料，降低到特定深度。通过定制的pipette支架施加特定参数的脉冲进行电穿孔。让染料在轴突内扩散特定时间，之后按参考文献中所述对动物进行心脏灌注，用于后续免疫标记。
07. 脑干切片和切片电生理学
如参考文献所述，从新生大鼠制作脑干切片。对于切片记录，细胞内pipette溶液中补充特定染料，以在记录结束时验证记录的结构。记录在生理温度下进行。细胞外溶液包含多种成分。在少数记录中，将特定离子浓度增加，或向细胞外溶液中添加特定物质。细胞外溶液用特定气体鼓泡，并通过在线加热器泵入记录室。在接近壶腹之前，等待浴槽温度稳定。记录在死后特定时间内进行。在相关放大器的特定模式下获得的电压记录，经低通滤波，由转换器数字化，并通过软件采集。双极刺激电极购自特定公司。刺激电流最大为特定数值（阈值通常低于特定数值）。补偿连接电位。电流钳记录中完全补偿串联电阻。在电压钳或电流钳模式下补偿杂散电容。电流钳模式下的杂散电容补偿产生更短且更大的动作电位，但未定性改变所报告的发现。
08. 钠通道免疫标记
对于免疫标记，如参考文献所述对幼鼠进行心脏灌注。钠通道标记如参考文献所述进行。使用共聚焦显微镜采集图像，对于钠通道标记，在成像相关结构之前，针对同一冠状切片中存在的特定细胞优化采集设置，这些细胞作为阳性对照。通常，相关结构中的标记强于特定细胞。使用特定软件进行三维渲染。相关图像在特定软件中进行对比度调整。其他共聚焦图像在特定软件中进行对比度调整。在特定软件中添加伪彩色。
本研究中使用多种抗体；使用高度交叉吸收的二抗。省略一抗或用对照肽抗原预孵育的对照实验将相关标记降低至背景水平。相关抗体的特异性已在小鼠中显示。
09. 动作电位抑制模型
动作电位抑制由一个模型描述，该模型包括膜电位的稳态效应及其对恢复速度的影响。抑制量由抑制系数的实际值决定，其范围为0到1。该值决定第i个动作电位相对于最大动作电位上升速率的大小：
在每个 AP 处，D 都会减少分数 d：
耗竭因子d可以理解为未被AP失活的钠通道比例。抑郁症的恢复需要经过一段延迟才能开始，因为AP必须先复极化。该延迟设定为每次记录中平均AP半宽的1.5倍。在此延迟之后，恢复情况如下：
D 放松至稳态抑制 DV，时间常数为 τV。假设 APi 和 APi+1 之间的膜电位恒定为 APi+1 的起始电位，对方程 S3 进行积分，可得出 AP 之间 D 的指数恢复：
其中 t0 是 AP 后开始恢复的时间点。DV 和 τV 均呈电压依赖性。电压依赖性效应基于膜电位对钠通道电导的影响，因为钠通道从失活状态恢复的时间常数依赖于电压，并且其稳态失活也依赖于膜电位。我们通过一组独立的实验测量了每个花萼的 Dv。在这些实验中，我们注入电流以偏置花萼的起始电位，并在 500 毫秒后刺激传入轴突以引发 AP。然后，可以使用以下方程分析 AP 上升率与起始电位的关系（类似于图 S5B 所示）：
其中 DV 由简单的逆玻尔兹曼方程描述：
包含两个自由参数：V0.5（半抑制电位）和 k（斜率因子）。需要注意的是，就我们的目的而言，多项式模型就足够了，因为我们只想准确估计 Vstart 如何转化为 Ymax。然而，玻尔兹曼方程预计与电压门控通道的失活曲线在生物学上一致。
τV 的电压依赖性基于对肾盏钠通道的电压钳研究。在研究的电压范围内，τV 与膜电位之间的关系几乎呈线性（r = 1.0）。通过线性回归，我们量化了该关系，并将其乘以温度校正因子，该因子也是从文中获得的：
为校正液体连接电位，我们在记录的膜电位上增加10 mV。请注意，基于霍奇金-赫胥黎电导模型，我们预期τV与Vm之间的关系遵循钟形曲线，因此公式S7中的线性外推可能低估τV。
拟合函数根据测量的起始电位和间隔迭代计算抑制系数D的变化。D初始值设为1。对于每个后续动作电位，使用公式S2和S4计算D的演变。通过使用公式S1和两个自由参数Ymax和d，借助特定软件中实现的“全数据集拟合”方法对测量的动作电位上升速率进行拟合；该方法能够通过使用整个数据集而非单个X-Y对来评估数据的迭代函数。该模型包含后电位的两种效应：（i）后电位设定τV，（ii）后电位决定DV。通过使用更简单的模型变体，我们可以评估后电位的这两种效应如何导致观察到的抑制。为分析抑制恢复的个体贡献，我们通过在公式S4中将Dv固定为1来排除稳态效应。通过排除抑制恢复来探讨稳态抑制的贡献，从而将公式S1简化为公式S5。
二、讨论
在这里，我们报告了对Held壶腹的体内全细胞和近细胞记录，该终末因易于进行切片记录而成为研究递质释放生物物理学的热门对象。在发育中的啮齿类动物中，Held壶腹以>200 Hz的爆发方式放电，无失败迹象，动作电位抑制或展宽极少，并能从动作电位抑制中快速恢复。我们将稳定电位Vstab定义为动作电位后的膜电位，在此电位下一个动作电位形状不变，并发现其接近静息膜电位（RMP）。此外，动作电位后的膜电位（Vafter）接近Vstab，这意味着在高频放电期间，当Vafter决定下一个动作电位的起始电位时，动作电位稳定性最大化。免疫标记表明，钠通道Nav1.6已存在于新形成的壶腹中，为切片和体内观察到的动作电位抑制缺失提供了分子基础。因此，这些结果揭示了Held壶腹自然放电期间快速信号传导的重要机制。
01. 自然活动中限制动作电位抑制的机制
我们观察到，壶腹动作电位的形状在体内放电期间显著不变。尽管在壶腹形成的早期阶段已观察到200 Hz的瞬时放电频率，但动作电位抑制极少。对于动作电位形状缺乏变化，两个因素似乎至关重要：动作电位抑制的快速恢复和动作电位之间使波形变化最小化的膜电位。
在切片记录中获得的动作电位抑制在很大程度上与动作电位之间的间隔无关。仅在极短间隔中观察到恢复中的时间依赖性成分。稳态抑制与时间依赖性恢复的结合充分描述了观察到的动作电位抑制，表明壶腹钠通道从失活中快速恢复为动作电位抑制的恢复提供了合理描述。免疫标记证据表明Nav1.6早期存在，其已知具有快速动力学和高频放电期间抗失活的特性；Nav1.6的存在与后期发育阶段Held壶腹的研究一致。未发现半轴突节存在的证据，其直到出生后第二周才形成，推测由髓鞘形成触发。胶质覆盖的增加和壶腹指状结构对杯状结构的取代，使得无法在体内研究成熟壶腹的特性。成熟壶腹在听力开始后具有更短的动作电位，壶腹钠通道的排除可能对此有贡献。
体内对抗动作电位抑制的第二个促成因素是Vafter接近Vstab，即动作电位形状不变的电位。体内RMP也接近Vafter，与先前的切片报告范围相同，尽管在大多数情况下报告了更负的RMP和更大的去极化后电位（DAP）。假设较大的DAP是由于更负的RMP，温度差异可能解释了与许多早期切片实验的差异，因为壶腹的RMP在生理温度下倾向于更去极化，而许多早期切片实验在室温下进行。由于Held壶腹的RMP由钾通道亚基、Ih、Na+/K+-ATP酶和持续性钠通道设定，这四种电导（或驱动力）中任何一种的细微差异都可能导致与某些先前切片研究相比观察到的RMP微小差异。除了阻断后对Vafter影响不大的钾通道亚基外，这些电导也可能有助于设定Vafter，其中其他钾通道和再生钠通道起额外重要作用。
再生钠电流不仅对Held壶腹的后电位有重要贡献，还促进更快的动作电位和更高频率的信号传导。再生钠电流很可能反映了辅助通道亚基的孔阻塞颗粒的解除阻塞，其在开放时可迅速阻塞Nav1.6。阻塞颗粒允许短暂的动作电位，并限制钠通道失活。在极短间隔时，钾通道的易化也可能有助于保持动作电位短暂。轴突钠通道的快速关闭有望提高动作电位的能量效率。由于该颗粒在负电位下解除阻塞而导致的钠通道短暂开放被视为副产物，但我们认为再生电流有助于将Vafter设定为接近Vstab，从而维持不变的动作电位放电。总之，这些适应性变化使动作电位即使在高频放电时也能保持显著稳定。
02. 功能意义
通常，后电位控制高频信号传导期间电压依赖性离子通道的可用性，并设定下一个动作电位的起始电位。已提出终末中后电位的更具体功能。去极化后电位（DAP）可能导致相关结构动作电位后兴奋性增加，但大的DAP可能导致钠通道失活和动作电位失败。突触前动作电位幅度的降低可能导致短期抑制，尽管这些变化可能被动作电位的展宽抵消。通过控制钙通道的失活，后电位可直接控制递质释放，但最近对Held壶腹的研究发现总钙内流在很大程度上与后电位值无关。在相关终末，DAP可能导致钾通道的累积失活，导致动作电位展宽，从而在高频爆发期间促成强突触易化。该突触的传递特性与Held壶腹突触或小脑苔藓纤维突触的中继功能显著不同，这种差异可能部分是由于Vafter比Vstab更去极化的结果。对于中途突触小体，其几何形状引起的阻抗不匹配使轴突易受频率依赖性传播失败的影响。电压指示剂的使用可能有助于测试此处确定的机制是否也有助于稳定突触小体中的动作电位速度并确保动作电位传播。
我们提出，与在相关研究中获得的数据一致，后电位的一个重要功能是保持突触前动作电位的形状。RMP、Vstab和Vafter的紧密对应不仅使动作电位的起始电位显著独立于放电频率，还导致动作电位形状显著稳定。对于Held壶腹这样的中继突触，其在宽范围放电频率下表现出精确性和可靠性，这具有明显优势。由于钠通道可用性变化引起的动作电位形状变化不仅会影响钙通道的开放、钙内流的时间和幅度以及神经递质释放，还会影响轴突传播速度，导致时间精确性丧失。我们得出结论，我们对Held壶腹的体内记录提供了对维持动作电位稳定机制的见解。未来的实验可能阐明Vafter与Vstab之间的关系如何被控制，以及它们的关系是否可以在Held壶腹和其他突触前终末动态调整。
三、材料与方法
所有实验均符合机构和欧洲指南，并经相关伦理委员会批准。简而言之，定时怀孕的母鼠购自相关机构并饲养在动物设施中。出生日定为P0。新生幼鼠用异氟烷麻醉，插管并机械通气，经腹侧入路暴露右腹侧脑干。记录前，麻醉剂减至1%异氟烷，使动物无反射。体内用电穿孔方法如相关文献所述。体内电生理方法详见相关文献。校正了基于葡萄糖酸钾的pipette内溶液的连接电位（-11 mV）。通过轻柔抽吸形成千兆密封，然后在特定模式下补偿pipette电容（Cp）。施加短暂抽吸以建立全细胞配置，并在破膜后立即测量RMP。在CC-fast模式下进行电压记录。记录经低通滤波（四极贝塞尔；10 kHz）并以25 kHz数字化。测量串联电阻（Rs）（图S1），但跨Rs的电压降离线校正。
如相关文献所述制作急性脑干切片。Rs完全补偿。在电压钳或电流钳模式下补偿Cp。记录经低通滤波（四极贝塞尔；10 kHz）并以25或50 kHz数字化。在特定环境中进行自定义分析。对于抑制模型，我们仅纳入解释总方差>70%的记录。
生物素荧光标记程序已在其他文献中描述。对于钠通道1.6的免疫标记，脑干切片（40 μm）进行抗原修复；随后按照相关文献中详细的缓冲溶液（pH 7.6）进行相同的免疫标记程序。更多细节见补充材料和方法。
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